卵泡刺激素对p-AKT蛋白、NF-κB蛋白表达的影响及机制研究

路晓琳

(邯郸市中心医院妇二科，河北 邯郸 056001)

0 引言

在当前的诸多研究结果中可知，FSH在与细胞表面的特异性FSH受体(FSHR)发生作用时，能够激活胞内的信号传导通路，并使其发挥相关作用，但具体关于其如何发生作用的机制并无相关研究结果予以证明。目前可知的是，肿瘤的发生、扩散、死亡以及生成血管和耐药性生产过程中[1]，磷脂酰肌醇3激酶和蛋白激酶B(PI3K/AKT)扮演了十分重要的角色。它能够或直接或间接的影响到细胞增殖、蛋白合成及凋亡相关因子等下游分子。而作为AKT具有特殊作用的下游分子之一的核转录因子(NF-κB)，控制着信号传导通路中枢。如果通过对其进行的异常活化刺激，可以在使得细胞增殖、凋亡等方面相关的基因转录进行有效调节，在使得细胞的外间质收到破坏后使得肿瘤细胞进行浸润和转移的目的。基于此，本实验将重点研究FSH是如何通过PI3K/AKT的途径在NF-κB、p-ART发生作用，为研究卵巢癌具体的发病原理及相应的从基因方面进行治疗，提供新的有力依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 卵巢腺癌细胞、人卵巢癌细胞株

卵巢腺癌细胞株为我院妇科实验室提供；人卵巢癌细胞株为我院实验中心所提供，均使用常规的RPMI-1640培养基进行培养。

1.2 方法

1.2.1 样本制备--细胞总蛋白

(1)选择卵巢癌细胞(上皮性)中的SKOV-3、3AO、40mIU/mL FSH和10µmol/L LY294002，随后单独并加入LY294002半小时，联合卵泡刺激素作用分别设置为一组。此时设空白对照组以便对比观察，分别在48h、24h之后去除培养液。随后，借助细胞传代的方式，采用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤，洗涤次数2遍，洗涤完成后将适量的消化液加入，借助显微镜，当发现细胞变圆，并且此时的细胞之间连接逐渐减少时，将2mL的PBS加入其中，起到吹打细胞之作用，并让其处于悬浮状态。把细胞悬液进行吸出处理，以800-1000 r/分钟的速度置于离心管进行离心操作5min。此时同时使用磷酸缓冲盐溶液洗涤两遍，然后进行离心除去。

(2)裂解液1mL，并对应将10mL的100mMPMFS加入其中，为获得更好实验效果，使细胞充分裂解，此时可将离心管借助器具进行振荡混匀的操作，随后将其处于冰冻环境中裂解30min。

(3)使离心机保持4℃，选择12000转速进行离心5min。

(4)最后，分离出上清并置于干净的离心管中，保存在-70℃中。

1.2.2 样本制备--细胞核蛋白、浆蛋白

(1)取上皮性卵巢癌SKOV-3、3AO培养细胞5~10×106个/mL，除去培养液。将此时的细胞在已经冷却的磷酸缓冲盐溶液洗涤两次；把胰酶消化液逐渐加入，如果细胞出现变圆，并且细胞之间的连接减少的现象时，加入2mL的磷酸缓冲盐溶液对细胞进行吹打。当细胞悬浮后，吸出悬液，放在1.5mL的离心管中；设置未4℃、1000×g，在离心机中进行4min的离心后，可能取干净上清，避免残液存留，估计细胞离心后的紧实细胞体积；

(2)按照10倍于细胞压积的冰浴的Lysis Solution A对细胞进行洗涤操作；在4℃的离心情况下收集细胞；

(3)按照3倍于细胞压积的冰浴的Lysis Solution A悬浮细胞，在0℃的情况下放置10min；借助显微镜进行观察，当发现七成的细胞破裂后，此时对细胞进行快速混悬数次。4000×g，15min，通过离心操作去除上清，获得细胞核，获取的上清就是需要制备的样品，为胞浆蛋白；

(4)加入与细胞核等体积，冰浴的Lysis Solution B充分混匀，在 0℃的情况下放置 30min，设置 15000×g，4℃，进行15min的离心操作，此时的上清即为核蛋白提取物；

(5)蛋白定量以取5~10μl核和浆抽提物进行操作，将其余分别置于-70℃下进行冻存。

1.3 统计方法

通过SPSS 22.0统计软件，对本次研究的所有重要数据进行分析。需要注意的是，计量资料以(±s)表示，采用t检验。

2 结果

2.1 四组细胞株SKOV-3中P-AKT、AKT1/2含量表达

卵泡刺激素组的SKOV-3中p-AKT含量显著高于其他三组，对照组与FSH+LY29400两组相较p-AKT显著减少，此时的差异具有统计学意义(P<0.05)。LY294003组与联合组相较无差异，四组AKT1/2蛋白表达相较不存在统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 四组细胞株SKOV-3中P-AKT、AKT1/2含量表达

2.2 四组细胞株3AO中P-AKT、AKT1/2含量、蛋白NF-κB含量表达

3AO细胞中，p-AKT蛋白表达，FSH组、LY29400两组及FSH/LY29400两组相比较于对照组，均存在统计学上的差异(P<0.05)。其中，FSH组的p-AKT蛋白表达相比于其余三组更多一些(P<0.05)；而对照组的表达明显多于LY29400两组、FSH/LY29400两组(P<0.05)。这几组之间的AKT1/2蛋白表达均存在一致性(P>0.05)。见表2。总提取蛋白中，NF-κB蛋白表达FSH组相比于对照组及LY29400两组明显较少(P<0.05)。而全部的四组中，以及其他组别之间比较存在一致性(P>0.05)。胞核中NF-κB蛋白表达四组之间，差异较大(P<0.05)，其中，FSH组与其他三组相比，存在表达明显增加(P<0.05)；其他三组相较表达减少，但无统计学差异(P>0.05)，同时这两组间的数据比较并无不同(P>0.05)；胞浆中NF-κB蛋白表达FSH组多于其他三组，但组间比较存在一致性(P>0.05)。

表2 四组细胞株3AO中P-AKT、AKT1/2含量、蛋白NF-κB含量表达(n=2)

3 讨论

AKT对下游分子的糖分代谢调节、细胞生长与增殖的介导、蛋白质合成的促进以及抑制细胞的凋零等方面能够通过参与信号转导通路产生作用。而NF-κB作为AKT重要的下游分子之一，根据现有研究结果可知，激活了PI3K可以磷酸化和活化NF-κB。在特定条件下[2]，即当细胞处于静止状态时，其细胞质中，NF-κB能够同其抑制性的辅助因子(IκB)进行结合，以达到促使IκB的降解的作用，使得NF-κB在复合物中分离，并在细胞核中定位，恢复NF-κB的转录活性。与此同时，IκB被降解后又迅速合成，同时与NF-κB结合于细胞核内[3]。NF-κB -IκB此时形成，其复合物能往细胞质中移位，NF-κB活化与失活的循环过程得以持续和完成。核蛋白NF-κB因为其对于免疫球蛋白κ轻链的转录具有调控作用，也因此被称之为核转录因子κB[4]，NF-κB1(p50/p105)、NF-κB2 (p52/p100)、p65(RelA)、RelB，C-Rel等，都是目前所知的NF-κB家族成员。通过将NF-κBP65与细胞质内的抑制蛋白IκB相结合，可组合为复合物，将P50的核定位位点进行一定掩盖，其在细胞质中处于非活性状态。本研究显示，卵泡刺激素组的SKOV-3中p-AKT含量显著高于其他三组，人卵巢癌细胞中p-AKT蛋白表达，卵泡刺激素组、LY29400两组及FSH/LY29400两组，相比较于对照组，存在统计学差异(P<0.05)。其中，FSH组p-AKT蛋白表达相比于其余三组较多(P<0.05)；而相对应的总提取蛋白中NF-κB蛋白表达FSH组，相对于对照组及LY29400两组减少较为明显(P<0.05)。

综上所述，FSHR受体存在于SKOV-3、3AO细胞中，FSH作用于SKOV-3、3AO后，PI3K/Akt途径成功被激活，p-AKT蛋白表达量显著提高的表达量，促使其下游分子在细胞核中，NF-κB蛋白的表达有所增加。