原花青素-明胶复合物为囊材的川芎和香附挥发油微囊的制备

李雪慧，徐 晖，孟 佳，贾卫茹，高启栋

（1.沈阳药科大学 药学院，辽宁 本溪 117004；2.辽宁省基础医学研究所，辽宁 沈阳 110101；3.辽宁省认证审评院，辽宁 沈阳 110036）

明胶（gelatin）是胶原蛋白水解产物，具有良好的生物相容性和生物可降解性，广泛用于胶囊剂、栓剂和半固体制剂以及注射剂辅料等[1-4]。明胶或明胶-聚阴离子（如阿拉伯胶、羟丙甲纤维素酞酸酯等）可通过单凝聚或复凝聚法制备载药微囊（microcapsules，MCs）[5]。由于凝聚为可逆的物理过程，需用甲醛或戊二醛等与明胶发生氨醛缩合反应，从而交联固化微囊，但游离的醛或其降解物会引起显著的细胞毒性，极大限制这种经典的微囊化方法在药物递送中的应用[6]。原花青素（proanthocyanidins，PC）是一种自然界广泛存在（如蔬菜、水果、种皮等）的多酚类化合物，其酚羟基可与带有氢键供体的分子通过氢键相互作用形成复合物，这提示是否可将 PC 作为交联剂用以固化明胶微囊[7]。

本文作者研究了 PC-明胶复合物的形成，以川芎挥发油和香附挥发油为模型药物，采用明胶-阿拉伯胶复凝聚法制备川芎和香附挥发油微囊（芎附微囊），探讨用 PC 作为交联剂固化载药微囊的应用可行性。川芎和香附挥发油是从川芎和香附的干燥根茎中提取的挥发油，具有活血止气、祛风止痛的功能[8-10]。川芎和香附挥发油易挥发、胃肠道刺激性大、稳定性差，利用微囊化技术将其包裹在高分子囊壳中，以期实现液体药物固体化、减少胃肠道刺激和增加稳定性的目标[11]。

1 仪器与材料

T18 Basic 高速分散机（德国 IKA 公司），OS20-S 顶置式搅拌器（大龙兴创实验仪器（北京）有限公司），BA300Pol 偏光显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司），LGJ-10E 冷冻干燥机（四环福瑞科仪科技（北京）发展有限公司），高效液相色谱仪（配备 2400 紫外检测器和 2130输液泵，日本 Hitachi 公司），傅立叶变换红外光谱分析仪（日本 Shimadu 公司），差示扫描量热仪（瑞士Mettler Toledo 公司），S-3400 扫描电子显微镜（日本 Hitachi 公司）。

2 方法

2.1 PC-明胶复合物的制备

称取 0.3 g 明胶，用适量水溶胀，加水使终体积为 100 mL，50 ℃ 水浴保温溶解。冰浴下，将质量分数 1% 的 PC 溶液 3 mL 滴入明胶溶液中，继续搅拌反应 1 h，取混悬液适量，用光学显微镜观察其形态。静置待分层后弃去上清，蒸馏水洗 3 次，-20 ℃ 预冻 12 h，冻干。

2.2 扫描电子显微镜（scanning electron microscope, SEM）观察

取适量冻干的 PC-明胶复合物，用导电胶固定在样品支架上，喷金，SEM 观察其表面形貌。

2.3 傅立叶变换红外光谱（fourier transform infrared spectroscopy, FTIR）分析

取明胶、PC、PC-明胶物理混合物和 PC-明胶复合物，分别与光谱纯溴化钾置于玛瑙研钵研磨，充分混合后，压片，置样品架上，测试。扫描波数范围：4 000～400 cm-1，分辨率：4 cm-1。

2.4 差示扫描量热（differential scanning calorimeter, DSC）分析

取适量明胶、PC、PC-明胶物理混合物和 PC-明胶复合物置于氧化铝坩埚中，以空白坩埚为参比，氮气气氛下测定。设定温度范围为 20～250 ℃，升温速率为 10 ℃·min-1。

2.5 川芎和香附挥发油乳剂的制备

以一定浓度的阿拉伯胶溶液为水相，川芎挥发油、香附挥发油、大豆油（体积比1:1:2）混合物为油相，将一定体积的油相快速加入到 5 mL 水相中，5 000 r·min-1高速剪切乳化 90 s，制得乳剂。

2.6 川芎和香附挥发油微囊的制备

2.6.1 以 PC 为交联剂制备

实际教学中，教师更多依赖自己的实践性知识，教师的实践性知识是建立在个人经验和前人经验的基础上，因此教师会通过对不同表征形式的吸收、借鉴来生成自己的实践性知识，实现专业发展。教师的实践性知识的表征形式是具体多样的，教师们会彼此交流教学心得，一个教研室的老教师会传授给新教师有用的教学经验，教师在教学过程中也会通过解决实际问题来积累经验。教师们各自掌握着“一套”管用的方法，有各自信奉的实践性知识，表现出不同的表征形式。有些教师擅长通过叙事、案例来管理教导学生，有些教师习惯借用意象、隐喻等解释内容。通过表征形式的交流使得实践性知识在教师群体间传递，可以促进教师个人性知识的形成，早日实现专业发展。

将上述乳剂转移至烧杯中，50 ℃ 水浴，500 r·min-1机械搅拌，加入质量分数 15% 明胶溶液（50 ℃）5 mL，滴加质量分数 10% 醋酸溶液调节体系 pH 值至 3.8，调节至合适的搅拌速度，加适量蒸馏水稀释，冷却至室温后冰浴 1 h。补加适量 4 ℃ 蒸馏水使总体积至 250 mL，调节搅拌速度至 400 r·min-1，滴加质量分数 1% PC 溶液 7.5 mL，继续搅拌 1 h。吸取适量微囊混悬液，光学显微镜下观察微囊的形态，用显微镜配置的软件测量不少于 200 个微囊粒径，计算微囊粒径。微囊混悬液静置后弃去上清液，蒸馏水洗 3 次，-20 ℃ 预冻 12 h，冻干，得干燥微囊（芎附微囊）。

2.6.2 以甲醛为交联剂制备

制备工艺相同条件下，将交联剂更换为体积分数 37% 甲醛溶液（375 μL，用蒸馏水稀释一倍），搅拌 15 min，用质量分数 20% 氢氧化钠溶液调节 pH 至 8.0～9.0，继续搅拌 20 min 得芎附微囊混悬液，冻干得干燥微囊。

2.7 微囊的形态变化

取芎附微囊混悬液 2 mL，加入 100 mL 质量分数为 1% 聚山梨酯-80 的磷酸盐缓冲溶液（pH 6.8），37 ℃ 水浴保温，100 r·min-1磁力搅拌，分别于 0.25、2、4 h 取样置光学显微镜下观察微囊的形态变化。

2.8 体外药物释放

取芎附微囊（粒径：(79.4 ± 5.0) μm）混悬液或芎附乳剂 2 mL，置于透析袋（截留分子量8 000）中。将透析袋置于 100 mL 含质量分数为 1% 聚山梨酯-8 0的磷酸盐缓冲溶液（pH 6.8）中，100 r·min-1磁力搅拌。分别于 0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、12、18、24 h 取释放介质5 mL，同时补加等体积的新鲜释放介质。样品溶液经 0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液用高效液相色谱测定藁本内酯（作为川芎挥发油的指标成分）和α-香附酮（作为香附挥发油的指标成分）。另取芎附微囊混悬液或芎附乳剂 2 mL，置 100 mL 量瓶中，微囊混悬液中加入少量胃蛋白酶溶液消解，用释放介质稀释至刻度，同法测定指标成分的含量。

藁本内酯测定的色谱条件：北京迪马 C18（200 mm × 4.6 mm，5 μm）色谱柱，50 mmol·L-1无水乙酸钠（乙酸调 pH 4.0）-乙腈（体积比 50:50）为流动相，检测波长 281 nm，流速 1 mL·min-1，柱温为室温。

α-香附酮测定的色谱条件：北京迪马 C18（200 mm × 4.6 mm，5 μm）色谱柱，乙腈-水（体积比65:35）为流动相，检测波长 250 nm，流速 1 mL·min-1，柱温为室温。

3 结果

3.1 PC-明胶复合物的形成

将 PC 溶液沿内壁缓慢加入到明胶溶液后，PC-明胶复合物在 PC 与明胶接触的瞬间以絮状沉淀的形式析出（图1A）。PC 分子向明胶溶液内部扩散，PC-明胶复合物随之不断产生。混悬液置光学显微镜下观察，可见大量大小不均的絮状颗粒（图1B）。

由 PC-明胶复合物在 SEM 下的观察结果可知（图1C），表面有大小不同的凹陷，可能是样品在冻干的过程中发生了塌陷。

为了研究 PC 交联明胶的作用机制，对明胶、PC、明胶-PC物理混合物以及明胶-PC 复合物进行红外光谱分析（图1D）。明胶的伯胺基峰在 1 629.98 cm-1处，3 425.38 cm-1峰归属于明胶羧酸基团的氧氢伸缩振动；PC 羟基峰在 3 382.94 cm-1处，1 611.31 cm-1和 1 517.87 cm-1峰归属为 PC 苯环骨架振动。明胶-PC 物理混合物没有出现明胶的特征峰，原因可能是 PC 特征峰强度较明胶大，且二者特征峰峰位相差不多，明胶的特征峰被掩盖。明胶-PC 复合物中，PC 酚羟基峰 3 382.94 cm-1红移至 3 305.92 cm-1；明胶氨基峰 1 629.98 cm-1蓝移至 1 652.02 cm-1，且强度明显增大。结果显示，明胶与 PC 形成复合物后二者之间存在氢键作用。

明胶和 PC-明胶物理混合物的 DSC 行为基本一致（图1E），在 100 ℃ 处有一宽钝峰，峰归属为明胶的结合水吸热气化；222 ℃ 为明胶的熔点峰，PC 与明胶形成复合物之后消失。

Fig.1 The characterizations of PC-gelatin complex图1 PC-明胶复合物的表征

3.2 芎附微囊的制备

3.2.1 阿拉伯胶浓度对乳滴粒径的影响

采用不同浓度阿拉伯胶溶液所制得乳剂的粒径（表1），随着阿拉伯胶浓度增加，乳剂外观呈均匀的乳白色，乳滴粒径减小；浓度大于 15% 时，粒径减小幅度并不明显，但体系的黏性增大，不利于后续微囊的制备，故选择阿拉伯胶浓度为 15%。

Table 1 Effect of gum arabic concentration on particle size of emulsion drops.表1 阿拉伯胶浓度对乳滴粒径的影响

3.2.2 制备工艺对微囊质量的影响

复凝聚法制得的芎附微囊悬液外观呈均匀黄色，静置后固化微囊缓慢沉降。显微镜下观察，可见微囊呈规则的球形或类球形，囊内包裹大量的小油滴（图2）。实验考察了显著影响微囊性质的处方和工艺条件，包括蒸馏水体积、搅拌速度和囊心体积对芎附微囊的形态和粒径的影响（表2）。体系中加入 90 mL 蒸馏水稀释，较加入 60 mL 和 120 mL 微囊粒径分布范围跨度小，平均粒径较小。搅拌速度对微囊粒径几乎没有影响，外观均圆整、未出现黏连。囊心体积分别为 0.9、1.1、1.3 mL时，制得的微囊平均粒径相差不大；囊心体积为 1.3 mL 时，所得微囊外观不规则；囊心体积为 0.9 mL较 1.1 mL 粒径范围小。

Fig.2 Typical micrographs of Chuanxiong and Cyperi volatile oil microcapsules (scale bar:100 μm)图2 典型的芎附微囊的显微照片（比例尺：100 μm）

Table 2 The morphology of MCs under different ratios of phase volume and dilution volume表2 明胶和阿拉伯胶凝聚时的浓度对微囊质量的影响

3.3 体外药物释放

由芎附微囊和芎附乳剂的体外释放结果可知（图3），川芎挥发油和香附挥发油体外释放行为基本一致，芎附乳剂释药迅速，2 h 时已基本释放完全；芎附微囊在体外有较好的缓释效果，释放曲线前部分斜率大，释药较为迅速，前 6 h 的累积释药量已超过 50%，后期释放缓慢，18 h 基本释放完全。

Fig.3 The ligustilide (A) and α-cyperone (B) dissolution profiles of Chuanxiong and Cyperi volatile oil emulsion and MCs (n=5)图3 芎附乳剂、微囊中藁本内酯（A）和α-香附酮（B）的体外释放曲线（n=5）

3.4 芎附微囊在体外释放介质中的形态变化

以甲醛和 PC 分别作为交联剂制备微囊考察其体外释放过程中的形态变化（图4）。甲醛较 PC分子量小，交联作用能够深入微囊内部，在释放过程中微囊形态几乎没有变化，4 h 出现开裂现象。PC 作交联剂的微囊在体外释放介质中的行为可分为吸水胀大（图4A）、囊壳破裂（图4B）和内容物泄漏（图4C）三个阶段。吸水溶胀是明胶的固有性质，芎附微囊与体外释放介质接触后，水逐渐进入微囊内部，微囊粒径明显增大；随吸水体积增加，囊壳较薄弱部位出现破裂，内容物从囊壳缺口泄漏，油滴和囊心未交联的明胶及阿拉伯胶由此分散到释放介质中，缺口增大，进而导致释放速率增快。囊壳在释放较为完全后，由于囊内缺少内容物支撑，可呈凹陷或折叠状态。

Fig.4 The morphology of Chuanxiong and Cyperi volatile oil MCs in dissolution medium at different times(scale bar:100 μm)图4 芎附微囊在体外释放介质中的形态变化（比例尺：100 μm）

4 讨论

明胶是两性电解质，分子中含有大量-NH2和-COOH，通过调节溶液的 pH 可使明胶带正电或负电；阿拉伯胶只含有-COOH，在水溶液中始终带负电。当溶液的 pH 小于明胶等电点时，明胶带正电，分子中的-NH2以-NH3+的形式存在，可与阿拉伯胶的-COO-静电作用力吸引从而形成凝聚物（图5A）。氢键是一种存在于分子内或分子间弱于共价键但强于范德华力的作用力，由极性很强的 X-H 键上的 H 与另一个（同个或者不同分子中）键上电负性很强且原子半径很小的原子（如 F、N、O 等）的孤对电子之间相互作用形成。FTIR 分析结果可以看出，PC 的酚羟基提供H 受体，明胶的氨基提供孤对电子，从而形成氢键（图5B）。PC 交联的明胶在 222.0 ℃ 的吸热峰（图1E）消失，结合 FTIR 分析结果，PC 与明胶形成分子间氢键，限制了明胶分子链的移动，使明胶的熔点升高。

Fig.5 The diagram of complex coacervation of gelatin and gum acacia (A).The diagram of gelatin crosslinked with PC (B)图5 明胶和阿拉伯胶凝聚示意图(A)，PC交联明胶作用机制示意图(B)

明胶是一种常用的微囊囊材，单凝聚或复凝聚法制得的微囊，通常需要用甲醛和戊二醛氨醛缩合反应得到固化的微囊[12]。本文作者选用天然来源的化合物，葡萄籽中提取的 PC 作为交联剂，避免了甲醛和戊二醛等的潜在毒性[13-14]。PC 的多酚羟基可与明胶的氨基通过分子间氢键作用形成水不溶的交联结构，这与已报道的实验结论相吻合[15-16]。选用 PC 替代甲醛或戊二醛等作为交联剂，具有来源广泛、毒性低、交联效率高等优点，且交联作用迅速。

5 结论

PC 可与明胶形成分子间氢键，反应迅速。本研究成功制得芎附微囊，掩盖了药物的不良气味，具有较好的体外释放结果，说明 PC 替代甲醛、戊二醛等传统交联剂切实可行，且 PC 为天然来源，安全性更高。天然来源交联剂 PC 的使用，扩展了以明胶为囊材的微囊化技术在药物递送领域的应用范围；微囊化技术在降低挥发油的挥发性，改善其释药行为方面具有广阔的应用前景。