注射用头孢米诺钠中有关物质HPLC检测方法的建立与验证

于涵光，徐亮

（1.天津医科大学药学院药物分析教研室，天津 300070；2.泊诺（天津）创新医药研究有限公司，天津 300022）

注射用头孢米诺钠（Cefminox Sodium for injection）其处方为头孢米诺钠（Cefminox Sodium）的无菌粉末，是头霉素衍生物，由半合成法制取。合成工艺由倪福震[1]总结王浩等采用了以7-MAC为原料的合成工艺路线[2]，分别经历了7-MAC的酰化，脱羧酸保护基，与D-半胱氨酸盐酸盐水合物的缩合制成粗品，重结晶精制；吴志军等[3]以7-ACA为原料，经历4步合成得到粗品，然后精制而成。头孢米诺钠其性质类似于第三代抗生素，具有抗β-内酰胺酶的作用，体内分布广泛，血药浓度达峰时间快，几乎无不良反应，所以，此品种市场竞争力较大[4-6]。头孢米诺钠目前收载于中国药典（CP）、日本药典（JP）以及相关企业注册标准及内控标准中，品种分别为原料和注射剂。《中国药典》2020年版二部（308页）收载了原料药头孢米诺钠及其制剂注射用头孢米诺钠，有关物质Ⅰ方法质量标准限度中没有订出已知杂质。《日本抗生物质医药品基准解说》中也没有对头孢米诺进行已知杂质标准的制定，所以本文通过对工艺及降解途径的研究，得出潜在已知杂质，然后建立反相HPLC方法，并对方法进行验证[7-8]。然后对6批样品进行有关物质的检测。

1 材料与方法

有关物质信息，笔者研究了头孢米诺钠的工艺及降解途径，得出了5个潜在杂质。其中，杂质1、5为工艺杂质，杂质2、3、4为降解杂质。主成分及各杂质信息见表1。

表1 头孢米诺钠中潜在杂质列表Tab 1 List of potential impurities in Cefminox Sodium

其中，杂质1与杂质5为工艺杂质，杂质2为主成分3位侧链水解产物，杂质3为δ-2位异构化变为δ-3的产物，杂质4为主成分4位侧链降解后与溶剂结合产物。笔者得到了各杂质对照品，以《中国药典》2020年版二部头孢米诺钠项下的有关物质方法为基础，筛选条件，建立方法。

1.1 供试品与对照品 注射用头孢米诺钠（韩国Kukje公司，批号：MMX11918X，MMX11919X，MMX11920X，MMX21910X，MMX21911X，MMX21912X）；头孢米诺对照品（中国食品药品检定研究院，批号：130508-201604）；头孢米诺系统适用性对照品（中国食品药品检定研究院，批号：130607-201802）；头孢米诺杂质1（商业定制）；头孢米诺杂质2（商业定制）；头孢米诺杂质3（商业定制）；头孢米诺杂质4（商业定制）；头孢米诺杂质5（商业定制）。

1.2 仪器与试剂 安捷伦1260液相色谱仪，Openlab 2.3 CDS工作站；赛多利斯BT125D十万分之一天平；赛多利斯MSA3.6P百万分之一天平；布兰德电子移液枪；甲醇（色谱纯）、四氢呋喃（色谱纯），冰乙酸（分析纯）。

1.3 方法的优化

1.3.1 《中国药典》2020年版色谱条件 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以醋酸溶液（1→100）-甲醇-四氢呋喃（990∶5∶5）为流动相；检测波长为254 nm；进样体积10 μL。

1.3.2 色谱柱筛选 按照限度浓度配制主物质与各杂质的混合溶液作为定位溶液（取供试品及各杂质对照品稀释并溶解制成每1 mL约含头孢米诺1.0mg，各杂质2 μg的溶液），分别选用安捷伦公司的Zorbax XDB-C18，250 mm×4.6 mm，5 μm；Zorbax SB-Aq，250 mm×4.6 mm，5 μm；Zorbax SB-C18，250 mm×4.6 mm，5 μm 3根色谱柱进样。

1.3.3 杂质稳定性考察 取上述定位溶液，连续进样6次，计算各杂质峰面积的RSD%。

1.3.4 稀释剂的优化 将稀释剂由醋酸溶液（1→100）-甲醇-四氢呋喃（990∶5∶5）改为水-甲醇-四氢呋喃（990∶5∶5），按照定位溶液配制方式，连续进样6次，计算各杂质峰面积的RSD%。

1.3.5 方法的建立 稀释剂为水-甲醇-四氢呋喃（990∶5∶5）。取本品适量，精密称定，加稀释剂溶解并稀释制成每1 mL中约含头孢米诺1.0 mg的溶液，作为供试品溶液（临用新制）。精密量取适量，用稀释剂定量稀释制成每1 mL中约含头孢米诺10 μg的溶液，作为对照溶液；精密量取对照溶液1 mL，用稀释剂定量稀释制成每1mL中约含头孢米诺0.5μg的溶液，作为灵敏度溶液。色谱条件为：选用反相色谱柱（Agilent Zorbax SB-Aq，250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为冰乙酸水溶液（1→100）-甲醇-四氢呋喃（990:5:5），稀释剂为水-甲醇-四氢呋喃（990:5:5），流速为1.0 mL/min，柱温为30℃，进样量为10 μL，检测波长为254 nm。取灵敏度溶液注入液相色谱仪，主成分峰高的信噪比应大于10。取供试品溶液与对照溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间约3倍，供试品溶液色谱图中如有杂质峰，杂质1、2、3、4、5的峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.2倍（0.2%），其他单个未知杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积（0.2%）；各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的1.5倍（1.5%）。

1.3.6 方法的验证

1.3.6.1 对照品贮备液的配制：取头孢米诺对照品及各杂质对照品适量至不同量瓶中，精密称定，分别制成100 μg/mL的溶液。

1.3.6.2 专属性：取供试品适量，精密称定，分别精密移取各杂质对照品贮备液至此量瓶中，用稀释剂稀释溶解制成含头孢米诺钠1 mg/mL，各杂质2 μg/mL的溶液。将此溶液注入色谱仪，记录色谱图，测定所有色谱峰之间的分离度。

1.3.6.3 准确度:标准品溶液：精密量取各杂质对照品贮备液至同一量瓶中，稀释制成各杂质2 μg/mL的溶液；未加标溶液：取供试品适量，精密称定，溶解并稀释制成含头孢米诺钠1 mg/mL的溶液；加标溶液：分别制备50%、100%、150%水平加标溶液：取供试品适量，精密称定，分别精密移取各杂质对照品贮备液至此量瓶中，用稀释剂稀释溶解制成含头孢米诺钠1 mg/mL，各杂质1、2、3 μg/mL的溶液。分别将各溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。计算各加标溶液的回收率及回收率的RSD%，回收率的范围均应在90%～108%，RSD%应不大于3。

1.3.6.4 重复性:标准品溶液、未加标溶液、100%水平加标溶液的配制方式同1.3.6.3准确度项下。分别将各溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。计算各加标溶液的回收率的RSD%，RSD%应不大于3。

1.3.6.5 定量限与检测限：逐级稀释各杂质对照品贮备液至同一量瓶中，注入色谱仪，记录色谱图。定量限混合溶液中，各物质的峰高的信噪比均应不小于10；检测限混合溶液中，各物质的峰高的信噪比均应在3～10。

1.3.6.6 线性与范围：精密移取各贮备液至同一量瓶中，分别稀释制成含各物质6、4、3、2、1.6、1 μg/mL的溶液（线性级别分别为：300%、200%、150%、100%、80%、50%），分别注入液相色谱仪，记录色谱图，得到浓度下的各物质峰面积。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线方程，计算相关系数R值。

1.3.6.7 校正因子：将得到的1.3.6.6项下的各杂质标准曲线的斜率分别除以头孢米诺标准曲线的斜率，即得到各杂质的校正因子。

1.3.6.8 耐用性：分别使用以下色谱条件进样标准品溶液、未加标溶液、100%水平加标溶液：柱温分别为25℃、35℃；流速分别为0.9、1.1 mL/min，检测波长252、256 nm。各耐用性条件下各杂质含量按外标法计算，均应不大于2%。

1.3.6.9 样品检测：用建立并完成验证的方法检测6批供试品有关物质，计算各杂质含量。

2 结果

2.1 方法优化结果

2.1.1 色谱柱筛选 使用色谱柱1、2，杂质4、5分离度均小于1，色谱图中，两峰未分开，使用色谱柱3，各杂质均能良好分离，最小分离度为1.3。图略。

2.1.2 杂质稳定性考察 各杂质峰峰面积的RSD结果如表2所示。杂质2峰面积的RSD%＞2。

表2 各杂质稳定性结果（峰面积）Tab 2 Results of stability of the impurities（peak area）

2.1.3 稀释剂的优化 笔者尝试不含乙酸的稀释剂，即：水-甲醇-四氢呋喃（990∶5∶5）。各杂质峰峰面积的RSD结果如表3所示。各杂质峰面积的RSD%均＜2，本研究使用此稀释剂。

表3 优化稀释剂后各杂质稳定性结果（峰面积）Tab 3 Results of stability of the impurities after optimize the diluent（peak area）

2.2 方法的验证

2.2.1 专属性 所得色谱图及各色谱峰之间的分离度结果如表4、图1所示。所有峰之间的分离度均大于1.2，专属性良好。

图1 加标供试品溶液图谱Fig 1 Chromatogram of spiked test solution

表4 专属性溶液峰结果Tab 4 Peak results of specific solution

2.2.2 准确度 各加标溶液的回收率及RSD%如表5所示。所有杂质回收率均在90%～108%，回收率RSD%均小于3，均符合规定。

表5 各杂质回收率结果（%）Tab 5 Results of recovery for each impurity（%）

2.2.3 重复性 各100%加标溶液中，杂质1、2、3、4、5的回收率的RSD%分别为1.832、0.472、0.724、0.484、0.654，均小于3，符合规定。

2.2.4 定量限与检测限 当各杂质峰高信噪比约为10时，头孢米诺、杂质1、2、3、4、5浓度分别为0.103、0.123、0.016、0.129、0.081、0.060 μg/mL，即为方法的定量限；当各杂质峰高信噪比约为3时，头孢米诺、杂质1、2、3、4、5浓度分别为0.041、0.049、0.007、0.052、0.033、0.024 μg/mL，即为方法的检测限。

2.2.5 线性与范围、校正因子 头孢米诺及各杂质的线性及范围结果为：头孢米诺在0.10～6.20 μg/mL范围内线性关系良好，回归方程为Y=9.523 2X-0.173 3，R2=1.000 0；杂质1在0.05～6.23 μg/mL线性关系良好，回归方程为Y=3.479 6X-0.355 5，R2=0.999 1，校正因子为2.73；杂质2在0.01～6.82 μg/mL线性关系良好，回归方程为Y=29.909 0X-0.858 1，R2=0.999 9，校正因子为0.32；杂质3在0.09～6.78 μg/mL线性关系良好，回归方程为Y=9.068 7X-0.284 9，R2=0.999 9，校正因子为1.05；杂质4在0.05～6.13 μg/mL线性关系良好，回归方程为Y=7.847 1X-0.141 3，R2=1.000 0，校正因子为1.21；杂质5在0.05～6.84 μg/mL线性关系良好，回归方程为Y=8.286 1X-0.178 6，R2=0.999 9，校正因子为1.15。

2.2.6 耐用性 各耐用性条件下，均有杂质含量变化超过2%，更换条件均不能满足耐用性要求。此方法应严格按照方法进行。各耐用性条件下各杂质含量变化如表6所示。

表6 耐用性结果（杂质含量，%）Tab 6 Results of durability（content of impurities，%）

2.2.7 样品检测6批样品检测结果如表7所示。其结果均满足质量标准的要求。

表7 6批样品有关物质检测结果（%）Tab 7 Test results of 6 batches of sample（%）

3 讨论

本研究建立了注射用头孢米诺钠中的有关物质的HPLC检测方法，以《中国药典》中头孢米诺钠项下的质量标准为基础，根据各杂质的性质筛选了反相色谱柱及稀释剂条件，其中筛选色谱柱使得各物质的分离度符合要求，筛选稀释剂增加了杂质的稳定性，使得方法验证能顺利进行。然后对此方法进行了方法验证，验证结果表明，该方法具有良好的专属性、准确度、重复性、线性范围，并计算出了各杂质的校正因子，方法需严格按照标准进行。最后检测了6个批次的样品，结果均符合质量标准的要求。综上，本方法成功建立，能准确检测本公司的样品。