阿卡地新对冠心病大鼠AMPK/FOXO1信号通路及心功能损害的影响

王书飞，刘蕾，杜林翔，张培培，左艳芳，逯党辉

（1.河南省周口市中心医院心脏及内科重症监护室，周口 466000；2.河南省人民医院血管外科，郑州 450000）

冠心病（coronary heart disease，CHD）是一种常见的心脏病，在世界范围内具有很高的死亡率和致残性。CHD的基本病理生理过程是动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS），容易形成斑块并阻塞血管，导致心肌缺血、缺氧或坏死[1]。炎症[2]、氧化应激[3]和血脂代谢异常[4]引起的AS是导致CHD发生、发展的重要原因，对其调控也成为临床治疗CHD的重要干预环节。目前，CHD的治疗方法主要包括冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention，PCI）和冠状动脉搭桥术（coronary artery bypass grafting，CABG），然而术后再狭窄和具有广泛病变的患者限制了其在CHD中的应用[5]。因此，迫切需要寻找一种非侵入性的方法来保护缺血性心肌。AMP活化蛋白激酶（adenosine monophosphate protein kinase，AMPK）在内皮细胞（endothelial cell，EC）、肝脏和大脑等多种组织广泛表达，研究发现在局部缺血或缺氧中，AMPK的激活可促进血管生成，抑制心肌细胞凋亡，保护心肌组织[6]，但其机制尚未完全了解。阿卡地新是AMPK特异性激动剂[7]，可促进AMPK磷酸化，改善心肌能量代谢，减轻体外循环术后心肌缺血再灌注损伤[8]；激活AMPK通路可保护冠状动脉血管内皮细胞的正常功能，对大鼠CHD具有一定的治疗作用[9]。故推测阿卡地新作为AMPK特异性激动剂可能对CHD大鼠心功能具有保护作用，本研究通过构建CHD大鼠模型，探究阿卡地对CHD大鼠心功能损害的影响及其潜在的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级健康Sprauge-Dawley（SD）雄性大鼠72只，体重（210±10）g，购自济南朋悦动物繁育有限公司，生产证号为SCXK（鲁）20140007，动物饲养许可证：SYXK（豫），动物批号：20150005。所有动物均严格按照动物饲养规则喂养，温度为（24±2）℃，湿度为50%～60%，12 h明暗交替，自由饮水和摄食。

1.2 药品及试剂 阿卡地新（加拿大StressMarq，货号：SIH-402，纯度：≥98%）；盐酸地尔硫卓注射液（山东方明药业集团股份有限公司，国药准字H20070254，10 mL:10 mg）；垂体后叶素（南京新百药业有限公司，国药准字H32026638，1 mL:6单位）；HE染色试剂、RIPA裂解液和BCA试剂盒（碧云天生物科技公司，批号分别为C0105、P0013B、P0012S）；SMT100V便携式全自动动物生化分析仪（江苏南京普朗医疗设备有限公司）；超高分辨率小动物彩色多普勒超声实时影像系统（Vevo 2100，加拿大VisualSonics公司）；肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌酸激酶同工酶MB（creatine kinase isoenzyme-MB，CK-MB）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、低密度脂蛋白-胆固醇（low density lipoproteincholesterol，LDL-C）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号分别为A032-1、E006-11、A001-3、A003-1、A007-1、A113-1）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）（RA20035）、白细胞介素-6（IL-6）（RA20607）ELISA检测试剂盒购自武汉贝茵莱生物科技有限公司；兔抗AMPK抗体（ab207442）、兔抗p-AMPK抗体（ab23875）、兔抗FOXO1抗体（ab179450）、兔抗p-F OXO1抗体（ab131339）、兔抗beta Actin抗体（ab8227）、羊抗兔IgG H&L（HRP）（ab205718），购自英国abcam公司；多功能酶标仪（iMark680，Bio-Rad公司）、荧光显微镜（日本Olympus公司）。

1.3 方法

1.3.1 大鼠分组与CHD模型的制备 采用随机数字表法将72只大鼠随机分为正常组、模型组、地尔硫卓组（1.0 mg/kg）[10]、阿卡地新高、中、低剂量组（2.0、1.0、0.5 mg/kg）[11]，每组12只。除正常组外，其余各组大鼠参照文献[12-13]采用高脂饲料喂养+腹腔注射垂体后叶素建立CHD模型，给予高脂饲料喂养8周后腹腔注射垂体后叶素（30 μg/kg），1次/24 h，连续注射3次，构建CHD大鼠模型。正常组给予基础饲料喂养8周后连续3 d腹腔注射等量生理盐水。高脂饲料：基础饲料81.3%、猪油10%、蛋黄粉5%、胆固醇3%、胆酸钠0.5%、丙硫氧嘧啶0.2%。8周后采集大鼠尾静脉血，用自动生化分析仪检测TG、TC、LDL-C验证建模结果：结果显示模型大鼠TG、TC、LDL-C水平均显著升高，模型制备成功。

1.3.2 给药方法 地尔硫卓组、阿卡地新各剂量组在造模完成后，腹腔注射相应剂量的阿卡地新，正常组和模型组大鼠腹腔注射等量生理盐水，1次/d，连续注射14 d。

1.4 检测指标与方法

1.4.1 心功能检测 末次注射阿卡地新2 h后，戊巴比妥钠麻醉大鼠，采用超高分辨率小动物超声影像系统测量大鼠左心室收缩末期内径（left ventricular end-systolic diameter，LVESD）、左心室舒张末期内径（left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD）、射血分数（ejection fraction，EF），短轴缩短率（fractional shortening，FS）。

1.4.2 心肌酶及炎性指标检测 心功能检测完成后，腹主动脉取血，静置后以3 000 r/min离心15 min，分离血清，检测血清中CK、CK-MB、TNF-α、IL-6水平，严格按照试剂盒说明书的步骤进行操作。

1.4.3 脂代谢指标检测 生化法检测血清TC、TG、LDL-C水平，溶液的配置及检测步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.4.4 氧化应激指标检测 取血后，取出大鼠完整心脏，于冰上用无菌手术刀片切分为3部分，一部分置于冻存管中，-80℃保存；一部分用4%多聚甲醛固定；另一部分按照1:9加入预冷的生理盐水研磨后，离心，取上清液，制备成10%的组织匀浆，生化法检测匀浆中MDA、SOD、CAT水平。

1.4.5 心肌组织HE染色 取4%多聚甲醛固定的心肌组织，乙醇梯度脱水，石蜡包埋，连续切3 μm薄片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱苯1 min，蒸馏水冲洗。常规HE染色，光镜下观察心脏组织形态变化。

1.4.6 Western印迹法检测心肌组织中相关蛋白的表达 取-80℃冰箱保存的心肌组织，加入RIPA裂解液研磨后，置于冰上，静置后离心，提取上清液为总蛋白溶液。用BCA法测量蛋白浓度后取等量蛋白质样品（30 μg/孔）上样，SDS-PAGE凝胶电泳，湿转法转膜，5%脱脂奶粉封闭，加入相应一抗（AMPK、p-AMPK、FOXO1、p-FOXO1按照1∶1 000比例进行稀释，β-actin 1∶5 000按比例进行稀释）于4℃下孵育过夜，HRP标记的羊抗兔IgG二抗（1∶5 000）室温孵育1 h，ECL显色，以β-actin为内参，通过与内参的灰度比，得出目的条带的相对表达水平。

1.5 统计学处理 本研究所得数据均采用SPSS22.0软件进行统计，计量资料以±s表示，当符合正态分布和同质性时，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）和Tukey事后检验，组间有差异进一步采用SNK-q检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 阿卡地新对CHD大鼠心功能的影响 与正常组相比，模型组大鼠LVESD、LVEDD显著增大，EF、FS显著下降（均P＜0.05）；与模型组相比，地尔硫卓组。阿卡地新高、中剂量组大鼠LVESD、LVEDD明显下降，EF、FS明显升高（均P＜0.05）；与地尔硫卓组相比，阿卡地新高剂量组LVESD、LVEDD、EF、FS差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。

表1 阿卡地新对CHD大鼠心功能的影响（±s）Tab 1 Effect of Acadixin on cardiac function in CHD rats（±s）

表1 阿卡地新对CHD大鼠心功能的影响（±s）Tab 1 Effect of Acadixin on cardiac function in CHD rats（±s）

注：CHD：冠心病；LVESD：左心室收缩末期内径；LVEDD：左心室舒张末期内径；EF：射血分数；FS：短轴缩短率；与正常组相比，aP＜0.05；与模型组相比，bP＜0.05；与地尔硫卓组相比，cP＜0.05

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2.2 阿卡地新对CHD大鼠血清心肌酶及炎性相关因子的影响 与正常组相比，模型组大鼠血清CK、CK-MB、TNF-α、IL-6水平显著升高（均P＜0.05）；与模型组相比，地尔硫卓组、阿卡地新高、中、低剂量组大鼠血清CK、CK-MB、TNF-α、IL-6水平明显下降（均P＜0.05）；与地尔硫卓组相比，阿卡地新高剂量组CK、CK-MB、TNF-α、IL-6水平差异无统计学意义（均P＞0.05），见表2。

表2 阿卡地新对CHD大鼠心肌酶及炎性相关因子的影响（±s）Tab 2 Effect of Acadixin on myocardial enzymes and inflammatory related factors in CHD rats（±s）

表2 阿卡地新对CHD大鼠心肌酶及炎性相关因子的影响（±s）Tab 2 Effect of Acadixin on myocardial enzymes and inflammatory related factors in CHD rats（±s）

注：CHD：冠心病；CK：肌酸激酶；CK-MB：肌酸激酶同工酶-MB；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL-6：白细胞介素-6；与正常组相比，aP＜0.05；与模型组相比，bP＜0.05；与地尔硫卓组相比，cP＜0.05

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2.3 阿卡地新对CHD大鼠脂代谢相关指标的影响 与正常组相比，模型组大鼠血清TC、TG、LDL-C水平显著升高（均P＜0.05）；与模型组相比，地尔硫卓组和阿卡地新高、中剂量组大鼠血清TC、TG、LDL-C水平明显下降（均P＜0.05）；与地尔硫卓组相比，阿卡地新高剂量组TC、TG、LDL-C水平差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表3。

表3 阿卡地新对CHD大鼠脂代谢相关指标的影响（±s）Tab 3 Effect of Acadixin on related indexes of lipid metabolism in CHD rats（±s）

表3 阿卡地新对CHD大鼠脂代谢相关指标的影响（±s）Tab 3 Effect of Acadixin on related indexes of lipid metabolism in CHD rats（±s）

注：CHD：冠心病；TG：甘油三酯；TC：总胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白-胆固醇；与正常组相比，aP＜0.05；与模型组相比，bP＜0.05；与地尔硫卓组相比，cP＜0.05

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2.4 阿卡地新对CHD大鼠心肌组织氧化应激指标的影响 与正常组相比，模型组大鼠心肌组织SOD、CAT水平显著降低，MDA水平显著升高（均P＜0.05）；与模型组相比，地尔硫卓组和阿卡地新高、中、低剂量组大鼠心肌组织SOD、CAT水平明显升高，MDA水平明显降低（均P＜0.05）；与地尔硫卓组相比，阿卡地新高剂量组SOD、CAT、MDA水平差异无统计学意义（均P＞0.05），见表4。

表4 阿卡地新对CHD大鼠心肌组织氧化应激指标的影响（±s）Tab 4 Effect of Acadixin on oxidative stress index of myocardial tissue in CHD rats（±s）

表4 阿卡地新对CHD大鼠心肌组织氧化应激指标的影响（±s）Tab 4 Effect of Acadixin on oxidative stress index of myocardial tissue in CHD rats（±s）

注：CHD：冠心病；SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛；CAT：过氧化氢酶；与正常组相比，aP＜0.05；与模型组相比，bP＜0.05；与地尔硫卓组相比，cP＜0.05

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2.5 阿卡地新对CHD大鼠心肌组织形态学变化的影响HE染色结果显示，正常组大鼠的心肌细胞排列整齐、心肌纤维结构完整清晰，染色均匀，未见心肌细胞水肿、坏死；模型组大鼠心肌组织染色不均，局部肌纤维横纹消失，心肌细胞形态不规则，排列紊乱，可见水肿变性，并伴有大量炎性细胞浸润；与模型组相比，地尔硫卓组和阿卡地新高、中剂量组大鼠心肌细胞水肿减轻，心肌纤维排列较为整齐，纤维断裂减少，少量炎性细胞浸润，见图1。

图1 大鼠心肌组织形态学改变(HE染色，200×)Fig 1 Morphological changes of myocardial tissue in rats(HE staining,200×)

2.6 阿卡地新对CHD大鼠心肌组织中p-AMPK/AMPK、p-FOXO1/FOXO1表达的影响Western印迹结果显示，与正常组相比，模型组大鼠心肌组织p-AMPK/AMPK、FOXO1蛋白表达显著降低，p-FOXO1蛋白表达显著升高（均P＜0.05）；与模型组相比，地尔硫卓组和阿卡地新高、中剂量组大鼠心肌组织p-AMPK/AMPK、FOXO1蛋白表达明显增加，p-FOXO1蛋白表达明显降低（均P＜0.05）；与地尔硫卓组相比，阿卡地新高剂量组p-AMPK/AMPK、FOXO1、p-FOXO1蛋白表达差异无统计学意义（均P＞0.05），见图2。

图2 阿卡地新对CHD大鼠心肌组织AMPK、FOXO1蛋白表达的影响Fig 2 The effect of acarbose on the expression of AMPK and FOXO1 protein in myocardium of CHD rats

3 讨论

炎症、氧化应激反应和血脂代谢异常在CHD的发生、发展中发挥至关重要的作用[14]。当心肌缺血时，机体代谢产物不能被及时清除，在体内大量堆积产生毒性作用，诱发心肌发生病变，导致心泵功能减退，血液流变学发生异常，引起血脂代谢异常；同时心肌缺血后会激活氧化应激反应，产生大量的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），生成和释放大量炎性因子（如TNF-α、IL-6），促进CHD的发生、发展。高脂饮食被认为是诱发脂代谢紊乱并导致CHD的必不可少的因素[12]。因此，本研究采用高脂饲料喂养联合腹腔注射垂体后叶素构建CHD大鼠模型，结果发现模型大鼠LVESD、LVEDD显著升高，EF、FS显著下降，提示CHD大鼠心腔扩大，心脏泵血量显著降低，不能满足机体的需要，心脏泵血功能衰竭；CHD大鼠血清CKMB、CK水平显著升高，HE染色结果也显示，心肌组织染色不均，局部肌纤维横纹消失，心肌细胞排列紊乱，并伴有大量炎性细胞浸润；说明CHD大鼠出现严重的心肌损伤；同时血清炎症和脂代谢相关指标水平显著升高，且心肌抗氧化指标（SOD、CAT）水平的显著降低，MDA水平的升高；提示CHD大鼠出现血脂代谢异常、炎症和氧化应激反应。

阿卡地新是一种腺苷类似物，能够模拟AMP功能，特异性激活AMPK。AMPK是一种位于真核生物细胞中广泛表达且高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，对炎症和氧化应激具有重要调节作用[15]；提高AMPK活性，可降低ROS水平，增加SOD生成，增强机体抗氧化能力[16]。而且AMPK通路可调控脂类代谢，研究发现脂联素可通过激活AMPK通路，抑制脂肪酸合成，增加血脂中脂肪酸的氧化，降低血脂水平，调节脂代谢紊乱，预防冠状动脉粥样硬化发生和发展[17]。阿卡地新能降低心肌细胞中ROS、脑钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）水平，调节心肌梗死后心肌功能[18]。本研究结果发现，给予阿卡地新干预后，大鼠LVESD、LVEDD明显降低，EF、FS明显升高，提示CHD模型大鼠心脏泵血功能明显改善；血清CKMB、CK水平明显降低，心肌损伤减轻，同时血清炎症因子（TNF-α、IL-6）、脂代谢相关指标（TC、TG、LDL-C）水平明显降低，心肌组织SOD、CAT水平明显升高，说明阿卡地新可抑制CHD模型大鼠的炎症和氧化应激反应，改善血脂代谢异常。

FOXO1是Fox家族成员之一，大量证据表明FOXO1是心脏代谢调节和维持心脏功能的重要因素，AMPK/FOXO1信号通路的激活具有心脏保护作用。FOXO1主要分布在细胞质中，但FOXO1的核定位是该基因调节功能的前提。在磷酸化状态，FOXO1被排除在细胞核之外，并以泛素依赖性方式在细胞质中降解。而AMPK激活后可直接阻止FOXO1的磷酸化，触发FOXO1蛋白从细胞质到细胞核的重新定位，并使FOXO1活性增加，降低细胞中活性氧的水平[19]；还可以增加脂肪酸β氧化，增强脂肪细胞的脂解作用，降低肌管中的脂质蓄积[15]。绞股蓝皂甙A可通过激活AMPK/FOXO1途径，保护心肌缺血/再灌注损伤[20]。作为AMPK的特异性激活剂，阿卡地新对CHD大鼠的保护机制是否与FOXO1有关？本研究采用Western印迹法检测了AMPK、FOXO1及其磷酸化蛋白的表达，结果显示阿卡地新可明显增加心肌组织p-AMPK/AMPK、FOXO1蛋白的表达，降低p-FOXO1蛋白表达；提示阿卡地新对CHD大鼠的心功能的保护作用，可能与激活AMPK/FOXO1信号通路有关。

综上所述，阿卡地新可抑制CHD大鼠的炎症和氧化应激反应，改善血脂代谢异常，保护心功能；其作用机制可能与激活AMPK/FOXO1信号通路有关。本研究为CHD的治疗和阿卡地新的临床应用提供了理论与实验参考，但尚存在一定不足，未设置通路抑制剂组进行验证，此外，由于条件限制，本研究只在动物水平进行了验证，下一步可从细胞水平上进行探讨。