NR2B启动子区域SNP位点生物信息学探究

迮浩城，陈勇胜，陈 珊，黄 靖，贾晨曦，田大为，李增鸣

空间定向是一种特殊的定向能力，指有机体在所处环境中正确辨识方向的知觉反应或能力。哺乳动物个体能正确辨认其所处环境中的当前地点、环境、自己所处位置与周围环境的关系，以及相互间的空间关系等。前庭功能异常导致空间定向障碍的发生，在成人前庭核中，谷氨酸能突触介导兴奋性神经传递，N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受体不仅调节中枢前庭神经元的放电特性。对成人中枢系统的研究表明，这2种电离受体的功能特性高度依赖于它们的亚基组成。含有NR2A亚基的NMDA受体是长时程增强 (long-term potentiation，LTP)所必需的，而具有NR2B的受体表达与学习记忆和空间定向等功能密切相关[1-2]。易感基因多态性的发掘是前庭系统发病机制研究方向之一，参与空间定向、前庭损伤等许多重要的神经认知过程[1-2]。NR2B含有谷氨酸功能结合位点，是NMDA受体中最重要的一个功能亚基[3]，转基因动物（小鼠）中枢内的NR2B含量为一般小鼠的双倍，定向能力（寻找水迷宫）明显增加；与未敲除NR2B小鼠比较，转基因小鼠空间记忆能力下降，学习能力受损，提示NR2B基因对于维持哺乳动物定向功能至关重要[4-5]。基因多态性，尤其是位于启动子区域的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP）与相关疾病关联密切[6-7]。已有研究主要就NR2B基因与神经系统疾病进行关联分析，NR2B基因启动子多态性位点与多种疾病相关[8-10]。本研究通过国外基因数据库对NR2B基因SNP进行生物信息分析，发掘其易感性，对外周系统疾病的防诊治提供客观的预测和监测指标。

1 资料与方法

1.1 人NR2B基因启动子SNP信息 人NR2B基因启动子SNP(+1 bp～-1.5 kb)位置在染色体-12反向序列中网址（http://www.ncbi.nlm.nih.gov /nuccore/，14133022-14134522，NCBI编号: NC_000012.11），在NCBI数据库中检索SNP（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp），发掘NR2B基因启动子SNP（1.5kb）。搜索选项为来源：人、染色体：12号、区间：17215035 to 17217560。人NR2B基因启动子SNP序列同源性采用加州大学医学数据库分析（http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway），多态性位点等位基因频率（不同人种）检索Ensembl数据库分析（http://www.ensembl.0rg/index.html）

1.2 方法

1.2.1 NR 2B基因启动子SNP和临近序列的同源率 数据库检索设置人NR2B基因启动子SNP为基准，检索其他物种的基因多态性（碱基一致）。人NR2B基因启动子SNP同源率=等位基因一致的物种数目之和/物种总量。设置SNP（各物种）20个碱基（上下游）为同源对比序列，分析各个物种与人类之间基因多态性位点周围序列的同源率，其平均值及标准差通过SPSS 22.0软件进行分析。

1.2.2 基因多态性临近序列转录调控元件 人NR2B基因启动子SNP临近序列（上、下游20个碱基）中的转录调控位点及元件通过TFSEARCH-on line数据库进行分析，最低可信值（q）限定0.85。

2 结果

2.1 NR2B基因启动子SNP及其等位基因频率（不同人种） 在NR2B基因启动子（+1 bp～－1.5 kb）检索到11个SNP，命名为S1-11（如图1），其中核心启动子区域有3个SNP，为S9-11。结果显示SNP的信息（SNP序列号、祖传和新生等位基因、在染色体上的位置）（表1）；NCBI上发布的SNP（不同人种）及其等位基因频率（Ensembl未提供S1、S-7），其中S2、S9-11对应的等位基因频率远低于单个等位基因频率，亚洲人群S2中A等位基因远高于C等位基因；欧洲人群S9中G等位基因远高于A等位基因；S10中中国汉族与日本人群（G/A比值）最低，美国人群其次，尼日利亚种族远高于上述人群；S11中美国人的A/G比值高于亚洲人种，提示NR2B基因启动子SNP等位基因频率的一个重要特性，即存在人种差异性（表2）。

图1 NR2B基因启动子区域上的多态性位点分布图

表1 NR2B基因启动子区域SNP相关信息

表2 NR2B基因启动子区域SNP不同人种等位基因频率

2.2 NR2B基因启动子序列保守性与多态性位点之间的关系 UCSC-on line数据库中，设置群体为大鼠、小鼠、狗、母牛和马，检索基因为NR2B，区域为启动子区，分析指标为保守性，结果提示如图2，目标基因启动子区序列和基因多态性位点保守性特点为，SNP（S1～S8）距离核心启动子越远，保守性越低；与之相反，SNP（S9～S11）距离核心启动子（+500 bp至+1 bp）越近，基因多态性位点所在序列的保守性越高（图2）。

图2 NR2B基因启动子区SNPs保守性分析

2.3 NR2B基因启动子SNP临近序列同源率的对比分析 图3（A）提示的是NR2B基因启动子SNP临近序列分析结果，对比序列中所列出的多态性位点等位碱基，即祖传等位基因，来源于Ensembldatabase，其中S1、S3-8、S10共八个基因多态性位点序列同源性一致；显示SNP祖传等位基因的同源率要高于新生等位基因，这说明祖传等位基因在哺乳动物中具有保守性；SNP临近序列的同源率变化与SNP祖传等位基因的同源率变化保持基本一致（图3B）。

图3 NR2B基因启动子区域SNPs及其邻近序列(F1-F11，上下游共20个碱基)的同源率比较

2.4 基因多态性临近序列上潜在的转录结合元件和包含的转录调控位点 采用TFSEARCH-database预测了含基因多态性位点等位基因临近序列上潜在的转录结合元件和包含的转录调控位点，数据显示（表3）：含S1-5、S8-11等9个基因多态性位点不同等位基因所在序列存在转录结合元件和包含的转录调控位点，而S6不同等位基因临近序列只能预测一个转录结合元件和包含的转录调控位点，含S7序列没有预测到转录因子结合元件。

表3 SNPs上潜在的转录调控元件及其相结合的调控因子

3 讨论

NMDA受体是中枢神经系统最重要的兴奋性氨基酸受体之一[11-12]，可调节中枢前庭神经元的放电特性。NR2B含有谷氨酸功能结合位点，是NMDA受体中最重要的一个功能亚基，转基因动物（小鼠）中枢内的NR2B含量为一般小鼠的双倍，水迷宫定向能力明显增加；与未敲除NR2B小鼠比较，转基因小鼠空间记忆能力下降，学习能力受损，提示NR2B基因对于维持哺乳动物定向功能至关重。Grassi等[13]发现NMDA受体不仅调节中枢前庭神经元的放电特性，而且还与α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid receptor，AMPA）相互作用，诱导前庭神经元间的长期增强。对成人前脑的研究表明，这两种电离受体的功能特性高度依赖于亚基的组成。含有NR2A亚基的NMDA受体是LTP所必需的，而具有NR2B的受体是长期抑郁的。Li等[14]研究发现含有Ca的AMPA受体。2+渗透亚基（GluR1，GluR3，GluR4）是诱导这2种形式的突触可塑性所必需的，离子型谷氨酸受体能够在出生后编码重力相关信息，但这些受体亚型在耳石器功能成熟中的具体作用仍有待阐明。

基因多态性的发掘是前庭系统发病机制的学说之一，参与空间定向、前庭损伤等许多重要的神经认知过程。目前运动病、前庭神经炎、良性阵发性位置性眩晕等前庭系统疾病均与环境因素与遗传环境交互作用引起，而基因多态性的功能意义对于改变基因或蛋白的表达与修饰，从而加大个体、人群和人种之间的遗传表性差异性，增加上述复杂疾病的发病率关系密切[6-7]。飞行人员抗晕机病能力不仅仅应关注于后期的环境锻炼（悬梯、滚轮、四柱秋千和多维旋转刺激），而从其发生的机制来看，先天的遗传因素更加决定了这种能力的强弱，因此，早期的功能评估和易感性筛查更为重要。选择易感基因启动子区SNP位点可以从影响转录结合原件或改变上述基因序列从而影响基因的表达和转录入手，本文中选择的SNPs均位于进启动子并且易感基因与前庭系统基因有一定关联性。研究结果发现S2、S9-11等位基因频率存在人种差异性，S5位点等位基因频率无人种差异性[15]；该易感基因启动子区位点的保守型特点在于距离核心启动子区的距离与保守程度成正比，这与距离核心启动区基因多态性位点与影响基因转录与翻译的概率正比的情况一致[16]，即核心启动子的SNPs可能参与靶基因的调控与表达，在线分析提示，不同转录因子结合元件位于含S1-5、S8-11等九个基因多态性位点序列中，一个转录因子结合元件位于含S6基因多态性位点序列，这些差异可能是SNPs影响NR2B表达的重要原因之一，这些分析将为进一步研究NR2B基因启动子区域SNPs与前庭系统疾病的关联性提供理论基础。