基于网络药理学探讨金柴饮治疗新型冠状病毒肺炎的作用机制

刘 莹 ,申 力，王兆博，曹洪欣

(1.中国中医科学院 中医基础理论研究所，北京 100700；2.黑龙江中医药大学 基础医学院，黑龙江 哈尔滨 150040；3.中华中医药学会，北京 100029）

新型冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）属于中医“疫病”范畴，流行广泛、传变迅速，具有寒热毒邪错杂、邪居肺卫与少阳、虚实并见、邪盛正衰等特点。透邪解毒法是导师曹洪欣教授结合近年突发疫病特点提出的治疗方法，用于治疗严重急性呼吸综合征（SARS）、甲流等突发性呼吸道病毒感染类疾病及各类感冒发热、疱疹性咽峡炎等[1-4]。透邪解毒法防治疫病，一方面给邪以出路，将疫毒之邪透达于外；另一方面扶助正气，激发人体驱邪能力。新冠肺炎流行初期，曹洪欣教授结合疾病特点及证候特征等，以透邪解毒法组方金柴饮防治新冠肺炎，对新冠肺炎易感人群、无症状感染者、确诊患者轻型、普通型、重型等具有一定的防治效果[5-7]。金柴饮以小柴胡汤为基础方，加金银花、连翘清解热毒、宣散邪气，荆芥透邪外出，茯苓健脾祛湿，浙贝母清肺化痰，共奏透邪解毒、宣肺益气、扶正祛邪之功。本研究采用网络药理学的基本方法分析金柴饮对COVID-19的治疗作用，预测其潜在分子机制，为深入研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 金柴饮目标化合物筛选

利用中药系统药理学数据库平台（TCMSP）检索金柴饮中各药物的化合物成分，依据口服利用度（oral bioavailability，OB）≥ 30%且类药性（druglikeness，DL）≥0.18的2个ADME 限定条件对获得的化合物成分进行初筛，从而得到金柴饮的活性成分。

1.2 目标化合物靶点预测

将金柴饮中的活性成分分别输入到PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），得到相应化合物的“Canonical SMILES”结构，再将其导入到Swiss Target Prediction平 台（http://www.swisstargetprediction.ch/），限 定 研 究 物 种 为 人 类（“Homo Sapiens”），预测金柴饮活性成分中的潜在蛋白质靶点。

1.3 新型冠状病毒肺炎（COVID-19）靶点收集

以“ novel coronavirus pneumonia”为关键词，检索OMIM数据库（https://omim.org/）与Gene Cards数据库（https://www.genecards.org/），收集疾病相关基因，合并2个疾病数据库靶点，删除重复值，获得新型冠状病毒肺炎的相关靶点。

1.4 金柴饮成分-新型冠状病毒肺炎靶点PPI网络构建

运用韦恩图在线制作工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），将金柴饮活性成分靶点与疾病基因靶点进行映射，得到交集靶点，即金柴饮治疗COVID-19的潜在作用靶点。将这些作用靶点导入STRING11.0数据库（https://string-db.org/），构建蛋白互作（PPI）网络模型，将生物种类限定为“Homo Sapiens”，获得蛋白互作关系，将数据保存为TSV格式文件。导入到Cytoscape 3.8.0软件中，利用软件中的“Network analyzer”功能分析靶点的网络拓扑参数，根据Degree值的大小排序，筛选出起关键作用的功能靶点。

1.5 金柴饮成分-新型冠状病毒肺炎靶点功能与通路的富集分析

将金柴饮治疗COVID-19的靶点输入到Metascape平 台（https://metascape.org/gp/index.html），P值设为小于0.01，对其进行GO分析及KEGG通路富集分析，保存结果,绘制气泡图对各类数据进行可视化。

1.6 金柴饮成分-新型冠状病毒肺炎靶点-通路网络图的构建

根据通路预测结果，在Excel表格中建立“化合物-靶点”“靶点-通路”的对应关系，将其导入CytoScape3.8.0，构建化合物-新型冠状病毒肺炎靶点-通路网络图，以该图来表示金柴饮治疗COVID-19“成分-靶点-通路”之间的相互关系。

2 结果

2.1 金柴饮中药活性成分获取

通过TCMSP数据库检索，初步获得金柴饮中药的化合物成分，经ADME值筛选后得到各药物活性成分共263个，运用Swiss Target Prediction数据库，得到活性成分靶点共4 476个，合并后删除重复值共得到靶点979个。药物活性成分及靶点情况见表1，方中部分化合物基本信息见表2。

表1 金柴饮“化合物-活性成分-靶点”基本信息Tab. 1 Basic information of“ Compound-Active ingredient-Target” in Jinchai Decoction

表2 金柴饮中交集化合物信息表Tab. 2 Information of intersection compounds in Jinchai Decoction

2.2 COVID-19相关靶点获取

由Gene Cards数据库收集到COVID-19潜在靶点260个，结合OMIM数据库补充相应靶点，合并后去除重复值，共得到261个疾病相关靶点。将筛选的金柴饮活性成分靶点与COVID-19疾病靶点取交集，绘制韦恩图，得到共同靶点75个，见图1。

图1 金柴饮与COVID-19靶点韦恩图Fig.1 Venn of intersection target of Jinchai Decoction and COVID-19

2.3 金柴饮成分-新型冠状病毒肺炎靶点PPI网络构建

将共同靶点提交至STRING11.0平台，得到75个靶蛋白的蛋白质相互作用关系数据，采用Cytoscape 3.8.0软件绘制靶蛋白PPI网络图，见图2。其中一个靶点TMPRSS11D没有网络相互联系，故剔除。最终包含74个节点，749条边（若两个靶蛋白之间存在相互作用关系，则用边连接两个靶蛋白），由“Network analyzer”工具筛选出该网络中degree值（度值）排名前10的靶蛋白，见表3。这些靶点基因可能在疾病治疗中发挥重要作用。

表3 金柴饮治疗COVID-19的关键靶点信息Tab. 3 Key target information of Jinchai Decoction in the treatment of COVID-19

图2 金柴饮PPI网络图Fig.2 PPI network of Jinchai Decoction

2.4 靶点功能与通路富集分析

通过Metascape数据库分析，共得到GO富集条目1 557条（P＜0.01），包含1 400个生物过程（Biological processes，BP）、106种 细 胞 功 能（Molecular function，MF）、51类 细 胞 组 分（Cell composition，CC）；KEGG 通路富集分析筛选得到152条（P＜0.01）,依据Count值分别选取排名在前的GO条目及KEGG通路绘制气泡图，见图3。结果显示，这些靶基因在BP方面主要参与细胞因子介导的信号通路、细胞对有机氮化合物、脂质、损伤等的应答过程，见图3（A）；在MF方面主要涉及磷酸转移酶活性、激酶活性、蛋白激酶活性等功能，见图3（B）。参与的通路主要有AGE-RAGE信号通路、HIF-1信号通路、细胞凋亡信号通路、PI3K-Akt信号通路、甲流等，见图3（D）。

图3 金柴饮主要成分潜在靶点的富集分析Fig.3 Enrichment analysis of potential targets of main components in Jinchai Decoction

2.5 金柴饮成分-新型冠状病毒肺炎靶点-通路网络图的构建

选取富集基因前20条的关键信号通路，建立“成分-靶点-通路”图，见图4。体现了金柴饮多成分、多靶点、多通路的作用特点。

图4 “成分-靶点-通路”网络图Fig.4 Network of "Component-Target-Pathway"

3 讨论

本研究共筛选出金柴饮中包含261种活性成分，其中豆甾醇、β-谷甾醇、槲皮素、山柰酚、木犀草素、黄芩苷等16种化合物存在于2种以上的药物中。药理学研究表明，这些化合物多具有抗炎、抗病毒的生物活性，如β-谷甾醇可通过减少NO的合成及抑制IL-6、IL-1、TNF-α等炎性因子的表达等作用而发挥抗炎作用[8]；槲皮素可通过与HA2亚基相互作用阻断病毒的融合，在A型流感病毒感染早期抑制病毒侵入[9]；山柰酚能够通过调控NF-κB信号通路抑制IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α等炎性细胞因子的释放而表现出明显的抗炎功效[10]，且对急性肺损伤具有潜在的治疗效果[11]。推断这些化学成分及其协同作用可能是金柴饮发挥药效的主要物质基础。

通过金柴饮核心成分-疾病关系网络，发现TNF、GAPDH、TP53、IL6、MAPK3、MAPK1、EGFR、CASP3、MAPK8、IL2为关键靶标。TNF、IL6、IL2为常见的促炎因子，参与炎性反应，调节免疫应答。研究表明，肺部感染、肺损伤时机体会释放大量的TNF-α[12]。IL-6为炎症急性期的反应指标，且在流感病毒性疾病中均呈现出过表达[13-14]。GAPDH是一种具有介导细胞凋亡、DNA修复和自噬等生理作用的多功能蛋白。对急性肺损伤具有保护作用[15]，而核心靶点中的MAPK1、MAPK3、MAPK8在急性肺损伤时常呈现异常表达，通过抑制其作用能够降低肺损伤的炎症参数[16]，增强肺泡巨噬细胞的自噬作用[17]。相关研究表明，P53突变能使肺上皮功能损伤[18]，P53基因及EGFR的突变与肺癌的发生息息相关，两者皆是肺癌的重要生物学标志[19]。综上可见，这些核心靶基因多与机体免疫系统调节、肺部炎症反应、肺部损伤等有关。

KEGG富集分析显示，金柴饮治疗COVID-19的信号通路主要涉及AGE-RAGE信号通路、缺氧诱导因子（HIF-1）信号通路、PI3K-Akt信号通路等。AGE-RAGE信号通路可通过诱导激活MAPK、NFκB，致使IL-1a、IL-6、TNF-α等促炎因子和细胞间粘附分子等的表达、释放，启动过度的炎症反应和自身免疫反应，影响氧化应激反应，引起组织损伤[20-21]。此外，晚期糖基化终产物的受体（RAGE）是一种促炎性模式识别受体，在过敏性支气管炎、肺炎、肺损伤、慢阻肺等疾病中其表达量增加[22]。PI3K/Akt、HIF-1信号通路关系密切，都参与了肺损伤、肺纤维化的发生过程[23-24]。而PI3K/Akt信号通路的激活能够通过介导细胞自噬、抑制线粒体分裂达到保护肺组织，减轻肺损伤的目的[25-26]。由此推测金柴饮可能通过调控上述相关通路发挥治疗作用。

4 结论

基于网络药理学的金柴饮作用机制研究表明，金柴饮能够通过多成分、多靶点、多过程、多通路等多种途径针对COVID-19的病因、病理改变而发挥抗病毒、抗炎、调节免疫功能、抗氧化应激等作用。本研究预测得到的金柴饮治疗COVID-19的内在机制还需要进一步实验予以验证，有待深入研究。