高龄孕妇蜕膜中ER/PR水平及其与妊娠结局的相关分析

郭叶青，刘 娟，李 阳，汤 宁，姚 穗

（1.湖南师范大学第一附属医院产科，长沙 410005；2.株洲中心医院妇产科，株洲 412000；3.浏阳市人民医院妇产科，浏阳 410300）

全面两孩政策实施后，高龄妊娠（35周岁以上）发生率显著上升，其妊娠并发症发生率也明显增加，包括流产、死产、早产、低出生体重、胎盘植入和子痫前期等［1，2］。有研究发现将高龄母亲的受精卵移植到“年轻”的子宫内进行发育，其后代心脏室中隔缺损的风险会大大降低［3］。还有学者［4］发现将高龄雌鼠胚胎置于年轻雌鼠子宫内代育能改善绝大部分胚胎和胎盘的发育异常。因此，高龄所致不良妊娠可能还与子宫密切相关。子宫蜕膜化是成功妊娠的关键因素之一，而雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）蛋白共同调控子宫蜕膜化［5］。为此，本研究检测了高龄孕妇蜕膜中ER、PR水平，并研究了其与妊娠结局的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料与分组对2018年1月～8月间于湖南师范大学附属第一医院产科住院分娩的孕妇，收集其一般资料和妊娠结局。纳入标准：自然受孕的单胎妊娠，孕周≥28周，且分娩时成功收集蜕膜组织。排除标准：胎儿染色体异常或胎儿畸形，子宫畸形，孕期有激素或免疫抑制剂治疗史，早产史，糖尿病或高血压家族史，宫腔操作≥3次，合并严重的内外科疾病。本研究方案伦理会委员会已批准，研究对象知情、自愿，并签定知情同意书。最终有141例纳入本研究，以年龄≥35周岁定义为高龄，根据年龄分为年轻组和高龄组，再结合妊娠结局分为高龄正常结局组、高龄不良结局组、年轻正常结局组和年轻不良结局组。

1.2 方法

1.2.1 诊断标准子痫前期、妊娠期糖尿病（GDM）、羊水过少、早产、胎儿生长受限（FGR）、新生儿窒息的诊断标准均参照人民卫生出版社谢幸等［6］编著的《妇产科学》（第9版）。分娩孕周依据末次月经和孕早期B超联合确定。

1.2.2 观察指标对高龄组和年轻组孕妇的一般资料（包括年龄、分娩孕周、孕产史、孕前BMI指数、新生儿出生体重、分娩方式等）和不良妊娠结局发生率分别比较。分析ER、PR表达情况与妊娠结局的关系。

1.2.3 蜕膜组织中ER、PR的检测胎盘娩出后30min内，在无菌操作下，于胎盘母体面中央切取大约为1.0cm×1.0cm×1.0cm大小的蜕膜组织（注意避开钙化、出血和坏死区）；用生理盐水洗净血渍及细碎组织，置于10%中性缓冲福尔马林液固定，脱水浸蜡和石蜡包埋，切片，采用SP免疫组织化学方法，由专人操作，实验步骤严格按照操作方法说明实施，实验设置HE染色对照、空白对照和阳性对照。

1.2.4 实验试剂兔抗人雌孕激素受体单克隆抗体均购自福州迈新生物技术公司；二抗试剂盒 Kit-0014购自福州迈新生物技术公司。SP免疫组化染色试剂盒和DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2.5 结果判定由同一位病理科医师观察切片。ER和PR阳性染色均主要定位于细胞核，ER与PR阳性细胞的判断：细胞核内出现浅黄色-桔黄色-棕黄色染色颗粒分布。依照Fromowitz综合计分法［7］。根据染色的强度分级：细胞核内没有染色或呈均匀一致的淡黄色，与背景一致的为0分；细胞核内可见少量的淡黄色颗粒，高于背景的为1分；细胞核内可见较多的深棕色颗粒为2分；细胞核内可见大量深棕色或褐色颗粒为3分。阳性细胞所占的百分率：无阳性细胞为0分；百分率≤25%为1分；百分率26%～50%为2分；百分率51%-75%为3分；百分率＞75%为4分。取以上两项之和：和为0-1分为（-）；和为2-3分为（+）；和为4-5分为（++）；和＞5分为（+++）。

1.3 统计学分析运用SPSS 21.0软件进行分析。计量资料以mean±SD表示，比较两组样本总体间差异采用独立样本t检验（方差齐）或Wilcoxon秩和检验（方差不齐），计数资料的比较采用χ2检验或 Fisher 确切概率法，ER与PR相关性采用Spearman相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料分析收集的孕妇共141例，其中年轻组88例，高龄组53例，年轻组与高龄组的年龄、分娩孕周、新生儿出生体重和不良妊娠结局发生率比较均有统计学差异（P＜0.05），两组孕妇孕次、产次、孕前BMI、剖宫产率、新生儿1分钟和5分钟Apgar评分分别比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），结果见表1。

表1 一般临床资料比较

2.2 不同年龄及妊娠结局组间ER、PR的比较单纯按照年龄或妊娠结局分组，高龄组ER、PR表达水平较年轻组均显著下降（P＜0.05）；不良结局组ER、PR表达水平较正常结局组均显著下降（P＜0.05）。结合年龄和妊娠结局分组，同一妊娠结局下高龄组ER、PR表达水平较年轻组下降（P＜0.05）；同一年龄段内，不良结局组ER、PR表达水平较正常结局组下降，但无统计学差异（P＞0.05）。结果见表2。

表2 不同年龄及妊娠结局组间ER、PR的比较

2.3 蜕膜中ER与PR表达水平的相关性分析蜕膜中ER与PR的表达水平呈弱正相关关系，有统计学意义（r=0.301，P＜0.05）（见表3）。

表3 ER与PR表达水平的相关分析

3 讨论

近年来，亚洲地区女性初产年龄上升2岁左右，高龄孕妇比例上升至19.1%［8］，高龄孕妇妊娠并发症及死亡率均有升高［9］。本研究也提示高龄组孕妇早产、子痫前期、GDM、前置胎盘、FGR等的发生率较年轻组显著升高。高龄妊娠患者不良妊娠结局的发生机制尚未完全阐明，多位学者［10，11］研究显示子宫内膜蜕膜化异常会导致“涟漪效应”，导致胎盘异常、胎儿发育迟缓、子痫前期和早产等不良妊娠结局。在子宫蜕膜化中PR至关重要，而且ER和PR在胚胎植入的发生中均不可或缺［12］。因此，本研究着重探讨了ER、PR与高龄及不良妊娠结局的关系。

3.1 ER、PR相关性及二者与高龄的相关分析本研究中发现蜕膜中ER与PR呈弱的正相关。Hewitt等［13］学者发现不仅ER的表达水平与E2作用相关，PR的表达也与E2水平相关。Ran［14］学者发现Shp2d/d小鼠子宫PR表达显著降低，与子宫基质中ERα激活受限有关，同时ER靶基因，包括胰岛素样生长因子1（Igf1）和表皮生长因子受体（ErbB-1）在Shp2d/d子宫中的表达也降低。提示PR和ER的表达可能存在某种程度的正相关关系，与本研究结论大致相同。

本研究发现不论按同一妊娠结局比较，还是总体比较，高龄组孕妇分娩后蜕膜中ER、PR水平较年轻组均显著下降。与大多学者的结论是一致的，如Woods等［1］发现在高龄雌鼠蜕膜异常表达的基因中，超过50%的失调基因均有雌激素受体Esr1和/或Pgr的结合位点，提示它们可能被雌激素或孕酮调控。Niklaus［15］和Gul［16］等均研究表明女性子宫中PR表达与年龄呈负相关。

3.2 ER、PR与妊娠结局的相关分析本研究发现不良妊娠结局组中ER、PR表达水平较正常结局组低，差异有统计学意义。与大多数学者研究结论一致，Langmia等［17］研究表明PR基因和表达水平下降与早产有关，推测可能是PR介导作用的丧失促使宫颈发生结构重建，常驻巨噬细胞增加，从而诱发早产［18］。有学者［19］研究发现胎盘中ESR1表达的降低以及ESR2和PGR蛋白的失活与先兆子痫的发病有关。结合既往文献，推测机制可能是ER、PR表达下降影响胎盘灌注及其分泌功能，从而导致子痫前期的发生。Kleiblova等［20］研究发现GDM患者皮下脂肪中ER较正常孕妇的表达降低，但胎盘中ER表达未见明显差异。Piltonen［21］等研究发现多囊卵巢综合征妇女子宫内膜基质细胞PR呈下降趋势，子宫蜕膜化反应受损，进而导致胎盘受损，发生不良妊娠结局。有学者［22］发现胎盘合体滋养层细胞中ERβ表达的下降与IUGR有关，可能与其导致NO输出降低，滋养细胞侵袭受损有关。但本研究也与部分学者研究结论不一致，有学者［23］发现PR-/-雌性大鼠比PR+/+的快速血糖偏低；有学者［24］曾对卵巢切除的孕鼠，予以维持妊娠的最低剂量孕激素刺激，发现PR受体表达率最高的胎盘基底区总重量以及胚胎重量均下降。暂未查询到关于新生儿窒息与ER、PR的相关研究，本研究中高龄与年轻组中新生儿窒息例数仅为1，可比性不大，有待扩增样本量后进一步探讨。本研究提示高龄组不良妊娠较正常妊娠发生率显著升高，而相同年龄段不良结局组ER、PR表达水平较正常妊娠结局组稍低，但无统计学差异。可能与同年龄段两组各自样本量小相关，还可能与不良妊娠结局一般是多因素多机制及多通道共同作用所致有关［6］。

综上所述，高龄孕妇不良妊娠发生率升高的原因之一可能与高龄所致ER、PR减少有关。我们可以进一步扩大样本量研究高龄孕妇孕早期蜕膜组织中ER、PR对妊娠结局的影响。鉴于母胎界面上的激素—细胞因子网络对免疫耐受起重要作用，且Paolino等［25］学者在Nature上发表的研究表明性激素可能通过RANK调控胸腺，从而影响母体免疫及代谢功能，导致流产、妊娠期糖尿病等的发生。我们可以通过动物实验进一步探讨ER、PR与免疫相关因子对蜕膜化和妊娠结局的影响，探讨其作用机制，为临床改善高龄孕妇不良妊娠结局提供理论依据。