王明辉,李永杰,李道宏,牟婧祎
1开封市妇产医院妇科,河南 开封 475000
2河南省人民医院妇产科,郑州 450003
宫颈癌是常见妇科恶性肿瘤,发病率和病死率均较高,严重影响患者的生活质量。研究显示,基因表达异常与肿瘤发生发展密切相关,这些异常表达的基因可参与调控肿瘤细胞的恶性增殖过程,这也是肿瘤靶基因治疗研究领域的重点。生长抑制因子4(inhibitor of growth family member 4,ING4)是肿瘤生长抑制因子家族成员,有核定位信号,可参与调控细胞生长。ING4
在多种肿瘤中发挥抑癌基因的作用,具有抵抗细胞生长和诱导凋亡的作用,其在卵巢癌、乳腺癌、胶质瘤等肿瘤中表达下调。ING4 的作用机制较为复杂,能通过调控多种信号转导通路发挥生物学功能。既往研究显示,ING4 通过影响WNT 信号通路参与调控肺腺癌细胞的生长。目前,临床对ING4 在宫颈癌中的表达及其对宫颈癌细胞生物学行为的调控机制尚不清楚。本研究首先初步探讨ING4 在宫颈癌组织和细胞中的表达差异,通过慢病毒转染上调ING4
的表达,探讨ING4 对宫颈癌细胞增殖、凋亡的影响和调控机制,现报道如下。选取2016 年7 月至2018 年12 月开封市妇产医院收治的宫颈癌患者。纳入标准:①经病理学检查确诊为原发性宫颈癌;②术前均未行放化疗和免疫治疗等相关治疗;③临床资料完整。排除标准:①合并其他恶性肿瘤;②合并精神疾病或精神疾病家族史;③合并智力或认知功能障碍。依据纳入和排除标准,本研究共纳入50 例宫颈癌患者,年龄28~78 岁,中位年龄59 岁;临床分期:Ⅰ期24例,Ⅱ期15 例,Ⅲ期11 例。取50 例宫颈癌患者的宫颈癌组织及相应癌旁组织。
ING4
过表达慢病毒由湖南丰晖生物科技有限公司构建。1.2.2 定量逆转录聚合酶链反应(quantitative reverse transcription- polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测宫颈癌组织和细胞中ING4
的相对表达量 分别取宫颈癌组织、癌旁组织、宫颈癌细胞 系Hela、SiHa、CaSki 和 正 常 宫 颈 细 胞 系Ect1/E6E7,采用Trizol 法提取组织和细胞中的RNA,紫外分光光度计测定RNA 的光密度(optical density,OD),OD/OD比值为1.8~2.0。采用cDNA 合成试剂盒反转录合成cDNA,取适量的cDNA,以SYBR Green qRT-PCR 进行定量PCR。PCR反应条件:95 ℃预变性10 min,95 ℃反应15 s,55 ℃孵育30 s,72 ℃孵育30 s。以β
-actin
作为内参,采用2法计算ING4
mRNA的相对表达量。β
-actin
上游引物:5'-CGAAACTACCTTCAACTCCATCA-3',下 游 引 物:5'-CGGACTCGTCATACTCCTGCT-3';ING4
上游引物:5'-GGACCTGAAGGCTGAAATTGAC-3',下游引物:5'-GTCACTGAGGGCATCCCATAC-3'。1.2.3 蛋白质印迹(Western blot)法检测宫颈癌细胞中ING4 蛋白的相对表达量 利用放射免疫沉淀(radio-immunoprecipitation assay,RIPA)蛋白提取试剂提取宫颈癌细胞系Hela、SiHa、CaSki 和正常宫颈细胞系Ect1/E6E7 中的总蛋白。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)凝胶采用10%的分离胶及4%的浓缩胶,常规方法配制。将提取的蛋白样品进行变性(与loading buffer 混合煮沸5 min)处理,上样孔内蛋白样品量为40 μg,设置浓缩胶中电压为80 V,分离胶中电压为120 V。肉眼观察染料跑出凝胶底部时停止电泳。按照1 mA/cm进行电转膜。取出聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,经过5%牛血清白蛋白室温封闭后,将PVDF 膜转移到一抗稀释液(NG4 一抗以1∶600 稀释)中,4 ℃孵育过夜,然后将PVDF膜放置于二抗稀释液[辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记,以1∶3000 稀释]中,室温中孵育1 h。电化学发光(electrochemiluminescence,ECL)法显色,利用Labworks 4.6扫描灰度值,以β-actin为内参,计算ING4蛋白的相对表达量。
1.2.4 慢病毒转染和分组方法 取ING4
mRNA 和ING4 蛋白相对表达量最低的宫颈癌细胞CaSki 进行转染,将宫颈癌细胞CaSki 接种至24 孔板,以MOI=20 的慢病毒转染细胞,24 h 后换液,培养72 h后观察荧光表达情况,结果显示,转染效率﹥90%,分别将转染ING4
过表达的慢病毒和稳定阴性对照慢病毒的细胞作为Lv-ING4 组和Lv-NC 组,将没有转染慢病毒的细胞作为对照组。1.2.5 CCK8 法检测细胞增殖能力 取对照组、Lv-NC 组、Lv-ING4 组宫颈癌细胞CaSki,接种至96 孔板,接种28 h 后取出细胞培养板,添加100 μl 的CCK8 溶液,然后置于培养箱中继续培养4 h。采用酶标仪测定450 nm 波长处的OD 值。
1.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡能力 取对照组、Lv-NC 组、Lv-ING4 组宫颈癌细胞CaSki,0.25%的胰蛋白酶消化,磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution,PBS)将细胞沉淀重悬洗涤2 次,最后将细胞悬浮于500 μl 的结合缓冲液中,然后依次添加Annexin V-FITC 和PI 染液,采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
1.2.7 Western blot 法 检 测 细 胞caspase 3、βcatenin、c-myc 蛋白的相对表达量 取对照组、Lv-NC 组、Lv-ING4 组宫颈癌细胞CaSki,按照1.2.3 中Western blot 法检测各组细胞caspase 3、β-catenin、cmyc 蛋白的相对表达量,其中caspase 3、β-catenin、c-myc一抗的稀释倍数分别为1∶400、1∶600、1∶600。1.2.8 WNT/β-catenin 信号通路激活剂LiCl 处理对ING4
过表达的宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响 收集稳定转染ING4
过表达的Lv-ING4 组宫颈癌细胞,分别以0、20 mmol/L 的WNT/β-catenin 信号通路激活剂LiCl 处理培养,分别作为Lv-ING4 组和Lv-ING4+LiCl 组,培养48 h 后,采用上述CCK8 法检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡能力,Western blot 法测检测各组细胞caspase 3、βcatenin、c-myc 蛋白的相对表达量。ING4
mRNA 的相对表达量为(0.32±0.02),明显低于癌旁组织的(1.42±0.06),差异有统计学意义(t
=17.93,P
﹤0.01)。宫颈癌细胞Hela、CaSki、SiHa 中ING4
mRNA 和ING4 蛋白的相对表达量均明显低于正常宫颈细胞Ect1/E6E7,宫颈癌细胞CaSki 中ING4
mRNA 和ING4 蛋白的相对表达量均明显低于宫颈癌细胞Hela、SiHa,差异均有统计学意义(P
﹤0.01)(表1)。表1 宫颈癌细胞Hela、CaSki、SiHa 和正常宫颈细胞Ect1/E6E7 中ING4 mRNA 和ING4 蛋白相对表达量的比较(±s)
ING4
mRNA 和ING4 蛋白相对表达量最低的宫颈癌细胞CaSki 进行转染,慢病毒转染后,Lv-ING4 组宫颈癌细胞CaSki 中ING4
mRNA 和ING4蛋白相对表达量均明显高于对照组和Lv-NC 组,差异均有统计学意义(P
﹤0.01);对照组与Lv-NC组宫颈癌细胞CaSki 中ING4
mRNA 和ING4 蛋白的相对表达量比较,差异均无统计学意义(P
﹥0.05)。(表2)表2 各组宫颈癌细胞CaSki 中ING4 mRNA 和ING4 蛋白相对表达量的比较(±s)
P
﹤0.01);对照组与Lv-NC 组宫颈癌细胞CaSki的OD 值和凋亡率比较,差异均无统计学意义(P
﹥0.05)。(表3、图1)表3 ING4过表达对宫颈癌细胞CaSki的OD值和凋亡率的影响(±s)
图1 流式细胞仪检测ING4过表达对宫颈癌细胞CaSki凋亡的影响
P
﹤0.01);对照组与Lv-NC 组宫颈癌细胞CaSki中caspase 3、β-catenin、c-myc 蛋白的相对表达量比较,差异均无统计学意义(P
﹥0.05)。(表4)表4 ING4 过表达对宫颈癌细胞CaSki 中caspase 3、βcatenin、c-myc 蛋白相对表达量的影响(±s)
P
﹤0.01)。(表5、图2)图2 流式细胞仪检测WNT/β-catenin信号通路激活剂LiCl处理对ING4过表达宫颈癌细胞CaSki凋亡的影响
表5 WNT/β-catenin信号通路激活剂LiCl处理对ING4过表达宫颈癌细胞CaSki的OD值和凋亡率的影响(±s)
P
﹤0.01)。(表6)表6 WNT/β-catenin 信号通路激活剂LiCl 处理对ING4 过表达宫颈癌细胞CaSki 中β-catenin、c-myc、caspase 3蛋白相对表达量的影响(±s)
ING4
在宫颈癌组织和细胞中表达下调,上调ING4
的表达后,宫颈癌细胞的增殖能力降低,这可能提示,ING4在宫颈癌进展中发挥类似抑癌基因的作用。肿瘤细胞凋亡率降低是肿瘤细胞恶性生长的基础,而细胞凋亡是一个复杂的过程,需要细胞内一系列基因通过复杂的调控网络共同诱导。目前,临床对细胞凋亡的研究发现,caspase 与细胞凋亡关系密切,caspase 由多个蛋白成员组成,这些蛋白成员被激活后可以形成一个凋亡级联反应,最终诱导细胞凋亡。caspase 3 在凋亡级联反应中位于最下游,也是细胞凋亡执行的关键蛋白,正常情况下,caspase 没有活性,只有被激活后形成caspase 3 才可以诱导细胞凋亡的发生,caspase 3 活化也被认为是凋亡不可逆的标志之一。本研究结果显示,慢病毒转染上调ING4
的表达后,宫颈癌细胞中caspase 3 蛋白的相对表达量升高,细胞凋亡率也升高,提示上调ING4
的表达可以诱导宫颈癌细胞发生凋亡,ING4
在宫颈癌进展中可能扮演抑癌基因的作用。本实验进一步探讨了ING4 的作用机制,结果发现,通过慢病毒转染上调ING4
的表达还可以降低宫颈癌细胞CaSki 中β-catenin、c-myc 蛋白的相对 表 达 量。β-catenin 是 经 典WNT/β-catenin 信 号通路的调控因子,其表达水平的高低与WNT/βcatenin 信号通路的激活水平直接相关。c
-myc
是位于WNT/β-catenin 信号通路的下游基因,WNT/β-catenin 信号通路激活可以促进c-myc 蛋白的表达。本实验结果显示,上调ING4
的表达能够抑制宫颈癌细胞CaSki 中WNT/β-catenin 信号通路激活。既往研究发现,WNT/β-catenin 信号通路在恶性肿瘤中过度激活,其活化水平升高可以促进恶性肿瘤的进展,阻断WNT/β-catenin 信号通路可以抑制肿瘤细胞的生长并诱导细胞凋亡。本实验发现,WNT/β-catenin 信号通路激活剂LiCl可以逆转上调ING4
对宫颈癌细胞增殖抑制和凋亡促进的作用,表明上调ING4
的表达可能通过调控WNT/β-catenin 信号通路影响宫颈癌细胞的增殖和凋亡。既往研究报道显示,ING4 作用机制与细胞内多种信号通路有关,其可以通过影响WNT 信号转导通路调控A549 细胞的生长过程。本实验结果表明,ING4 参与宫颈癌进展可能与WNT/βcatenin 信号通路有关。综上所述,ING4 在宫颈癌中表达下调,ING4能够抑制宫颈癌细胞的增殖并诱导其凋亡,其作用机制可能与下调WNT/β-catenin 信号激活程度有关,这为今后进一步研究ING4 在宫颈癌进展中的作用和具体调控机制提供了参考资料。