冻藏的温度波动对三文鱼化学指标值及持水力的影响

朱轶群，杨永安，刘建福，田继源，李静静

（天津商业大学机械工程学院，天津 300134）

三文鱼学名为大西洋鲑鱼。中国对三文鱼的消费需求越来越高，在2018 年的前3 周时间里，挪威出口到中国的三文鱼总量上涨到了557 t[1]。三文鱼属于冷水鱼类，适宜生活在温度较低的高纬度地区，如挪威、智利、俄罗斯、美国和日本等国家[2]。

三文鱼是世界名贵的食用鱼类之一，肉色多为红色或橙红色，肉质紧密细腻，口感柔润嫩滑，深受消费者喜爱，有重要的商业价值。其营养价值也很高，富含蛋白质、ω-3 不饱和脂肪酸、维生素等。ω-3 不饱和脂肪酸具有能有效降低血脂和血胆固醇、预防心血管疾病、脑功能退化和老年痴呆等功效[3]。100 g三文鱼约含3～20 mg 的维生素A，维生素A 促进胎儿发育和生殖能力，有益于人体的视力和免疫力。100 g 三文鱼约含3～9 mg 维生素B12，维生素B12对人体内新细胞的形成十分重要。100 g 三文鱼能提供人体每日所需的80%～100%的维生素D。

三文鱼中富含水分、蛋白质、不饱和脂肪酸等营养物质，易被细菌侵染、脂肪易发生氧化、分解。冷冻是三文鱼保藏的重要方式之一，占有重要地位。远洋捕捞后空运过来的三文鱼在没有上市前需要冷冻长期储存。秘鲁出口冷冻三文鱼占出口总额的42%[4]。中国进口三文鱼主要为鲜冷和冷冻三文鱼，中国每年从日本进口4～6 万吨冷冻三文鱼[2]。另外，三文鱼中可能含有一些寄生虫，低温冷冻可以杀灭寄生虫。

冻藏温度达到−18 ℃时，三文鱼冻结率达90%。冻藏温度在−40 ℃以下使几乎全部自由水冻结，能够更好的保持三文鱼的品质[5−7]。由于一大部分三文鱼肉被消费者生食，常以超低温（−50 ℃以下）冻藏的方式进行保鲜[8]。而建造温度达到−40 ℃以下的超低温冷库成本大，制冷系统COP 低，耗能高。超低温冻藏过程中，温度精准控制不易，温度波动较高，并且会出现局部温度偏差[9]。

温度波动使食品中冰晶重新结晶，改变微观结构，不可逆转地损伤细胞和组织，加速变质[10−11]，再结晶降低了冷冻食品的质量和保质期[12]。短期冰鲜冷藏温度波动对三文鱼的品质的影响已有很多研究报道[13−15]，王一帆等[15]在4 ℃冻藏环境下，得出(4±0.1) ℃三文鱼样品的高品质货架期比(4±2) ℃长近1 d。张宁等[16]研究表明贮运期间多次温度变化的三文鱼pH、失重率、TVB-N、菌落总数及K 均上升，感官评分下降，品质远低于始终处于0 ℃的三文鱼肉。然而，冻藏条件下，温度波动对三文鱼的化学指标及持水力的影响报道较少。

−18 ℃低温冻藏冷库比−50 ℃超低温冻藏库具有明显的建设成本与运行成本低的优势。本研究旨在 通 过 对 比 分 析−18 ℃组（(−18±2) 、(−18±1)、(−18±0.5) ℃）和−50 ℃组三文鱼样品的化学品质及持水力的变化，探讨减小−18 ℃环境温度波动达到−50 ℃超低温环境的冻藏效果的可行性。即通过研究三文鱼样品在−18 ℃冻藏环境下，温度波动对其化学品质和持水力的影响，验证将−18 ℃三文鱼样品的温度波动减小到一定程度，可以在短期冻藏时间内将三文鱼样品的冻藏温度从−50 ℃提高至−18 ℃，从而降低制冷系统能耗，节约建设成本与运行成本，为开发低温冷库提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

挪威三文鱼 当地捕捞去除内脏后，冰藏空运至天津市，由天津市红桥区麦德隆商场的专业人员在冷藏环境对鱼剔骨、鱼背肉切块，通过采用铺碎冰的保温箱将其快速运回并冻藏；硼酸（青海利亚达化工有限公司）；盐酸、高氯酸（国药集团化学试剂有限公司）；甲基红乙醇、溴甲酚绿乙醇（上海熹垣生物科技有限公司）；三氯乙酸、硫代巴比妥酸、磷酸、氢氧化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾（天津市盛鑫源伟业贸易有限公司）；腺苷三磷酸、腺苷二磷酸（湖北鸿鑫瑞宇精细化工有限公司）；肌苷酸（西安拉维亚生物科技有限公司）；腺苷酸、次黄嘌呤核苷、次黄嘌呤（湖北万得化工有限公司）。

UDK159 全自动凯氏定氮仪 意大利VELP 公司；Thermo Evolution 201 紫外可见分光光度计 美国Thermo Scientific 公司；Waters e2695 高效液相色谱仪 美国Waters 公司；DHG-9140 电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；NMI20-025V-1 核磁共振成像分析仪 美国 Hunterlab Associates lab Inc 公司；SMART 200PLC 控制器 德国西门子股份公司；MBT153PT100 温度传感器 丹麦丹佛斯。

1.2 实验方法

1.2.1 实验设计 将三文鱼样品的冻藏环境温度分为温度波动组和对照组两个组，温度波动组为（−18±0.5）、（−18±1 ）、（−18±2） ℃组，对照组为（−50±0.1） ℃。实验冻藏6 个月期间，每隔1 个月对冻藏三文鱼样品的品质指标进行分析。不同温度波动冷柜的控制是通过独立编程的PLC 控制系统实现的，根据温度波动设置制冷启停温度，使得冰柜的温度维持在启停温度之间。例如（−18±0.5） ℃，设置的制冷机开启温度为−17.5 ℃，停机温度为−18.5 ℃。

1.2.2 TVB-N 值（total volatile base nitrogen, TVBN）的测定 采用GB 5009.228-2016《食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定》自动凯氏定氮法[17]。冻藏三文鱼在4 ℃冰箱中解冻12 h 后绞碎，称取10 g 放入250 mL 锥形瓶内，加100 mL 水，间歇振摇，浸渍30 min 后过滤，吸取10.0 mL 滤液滴入蒸馏管中，然后放入1 g 氧化镁。设定蒸馏时间180 s。硼酸接收液30 mL，滴加10 滴混合指示液。使用盐酸标准溶液（0.1000 mol/L）滴定硼酸，采用颜色变化方式判断滴定终点。每组不少于6 个测试结果，取平均值。

三文鱼样品的挥发性盐基氮含量按以下公式计算：

式中：X 为TVB-N 含量，mg N/（100g）；c 为盐酸标准溶液实际浓度，mol/L；V1为消耗的盐酸标准液的体积，mL；V0为试剂空白消耗的盐酸标准液的体积，mL；m 为样品质量，g；V2为样液总体积，mL；V3为测定样液体积，mL；14 为与1.00 mL 1 mol/L盐酸标准液相当的氮的质量，mg。

1.2.3 TBARS（Thiobarbituric Acid Reactive Substance，TBARS）值的测定 参照Salih 等[18]的TBARS 值测定方法，稍有改动。取在4 ℃下解冻12 h 绞碎后的5.00 g 三文鱼样品于100 mL 锥形瓶中，将质量分数为25%的50 mL 三氯乙酸加入其中，摇匀密封，在恒温振荡器上50 ℃振摇30 min 后冷却至室温，过滤，称取滤液5 mL 和标准系列溶液5 mL 分别置于25 mL 具塞比色管内，另外量取三氯乙酸5 mL 作为样品空白，分别向其中加入TBA 溶液5 mL，将三组溶液加塞混匀后进行30 min 的90 ℃水浴，冷却到室温后，以样品空白调节零点，于532 nm 处1 cm光径测定样品溶液的吸光度值和标准系列溶液的吸光度值[19]。

TBARS 值用丙二醛质量分数表示。三文鱼样品中丙二醛含量按以下公式计算：

式中：X 为丙二醛含量，mg/（kg）；c 为从标准系列曲线中得到的试样溶液中丙二醛浓度，μg/mL；V 为定容体积，mL；m 为最终试样溶液所代表的试样质量，g。

1.2.4 K 值的测定 参照汤水粉等[20]的方法，略有改动。称取在4 ℃下解冻12 h 绞碎后的（2.00±0.02） g 三文鱼样品于50 mL 普通离心管中，加入20 mL在4 ℃下冷却的10%高氯酸溶液后涡旋振荡1 min，取其在4 ℃下 8000 r/min 离心10 min 后的上清液。用20 mL 5%的高氯酸溶液重提沉淀物，取其在4 ℃下8000 r/min 离心10 min 后的上清液，合并两次的上清液。将上清液的pH 用10 mol/L 的NaOH 溶液调节至近6.0，继续将其pH 值用1.0 mol/L的NaOH 溶液调节至6.0～6.4，采用蒸馏水将该混合液定容到50 mL。在4 ℃下8000 r/min 离心10 min后采用0.22 μm 的微孔滤膜将上清液过滤，滤液用于高效液相色谱分析。色谱条件：ODS-sp 色谱柱，150 mm×4.6 mm，粒径5 μm。柱温35 ℃。流动相为 0.02 mol/L KH2PO4和0.02 mol/L K2HPO4（1:1）溶液，用磷酸调节pH 至6.0。进样量20 μL，流速1.0 mL/min，检测波长254 nm。

K 值是表征鱼类新鲜度的指标。通过ATP 关联物含量的变化可计算出K 值。

式 中：MATP是 样 品 中ATP 的 含 量，μmol/g；MADP是样品中ADP 的含量，μmol/g；MAMP是样品中AMP 的含量，μmol/g；MIMP是样品中肌苷酸（Inosine Monphonsphate, IMP）的 含 量，μmol/g；MHxR是样品中次黄嘌呤核苷（inosine, HxR）的含量，μmol/g；MHx为样品中次黄嘌呤（Hypoxanthine, Hx）的含量，μmol/g。

1.2.5 持水力的测定 参照王硕等[21]的方法。准确称取不同温度波动范围条件下冻藏的三文鱼样品2.0000 g，用定性滤纸包好，5000 r/min 离心10 min后称量质量，按照如下公式计算质量损失率。

式中：m1是离心前鱼肉质量，g；m2是离心后鱼肉质量，g。

1.2.6 低场核磁共振（Low-field nuclear magnetic resonance,LF-NMR）T2时间测定 参考Liu 等的方法[22]，略作修改。采用NMI20-025V-1 核磁共振成像分析仪测量。质子共振频率为20.827 MHz。设置仪器参数：采样频率SW 为200 kHz，采样点数TD 为240012，重复采样间隔时间TW 为2500 ms，累积次数NS 为4，回波时间TE 为0.2 s，回波个数NECH 为6000。

1.2.7 数据分析 实验中分别采用Excel 软件、Origin Pro 8.5 软件、SPSS 20.0 软件、ANOVA 进行实验结果统计、绘制分析图、Pearson 相关系数分析、单因素方差分析（P<0.05 表示差异显著）。实验数据都按照“平均值±标准差”来表示。

2 结果与分析

2.1 温度波动对冻藏三文鱼TVB-N 值的影响

图1 为三文鱼的TVB-N 值在冻藏期间的变化。随着冻藏时间的延长，三文鱼的TVB-N 值持续增加。TVB-N 值是测定蛋白质在微生物和酶作用下分解产生碱性含氮物质的总量，TVB-N 值可以作为肉类的腐败指标[23]，当TVB-N 值在25 mg N/100 g以下时三文鱼可以生食[15]。随着冻藏时间的延长，在酶和细菌的作用下蛋白质分解产生氨及胺类等碱性含氮物质不断积累，因而TVB-N 值不断增大。

图1 冻藏期间三文鱼TVB-N 值的变化Fig.1 Changes in TVB-N value of salmon during frozen storage

三文鱼TVB-N 值随着冻藏环境的温度波动幅度增大而显著增加（图1）。三文鱼冻藏前的初始TVB-N 值为6.21 mg N/100 g，−18 ℃冻藏环境的温度波动为± 0.5、± 1 ℃和± 2 ℃时，冻藏6 个月后TVB-N 值分别增大到19.06、23.25 mg N/100 g 和25.91 mg N/100 g。温度波动越大，使得组织中冰晶重结晶和进一步生长，破坏了肌纤维结构，释放氧化酶等促氧化因子的速率越快，使蛋白质氧化分解生成的碱性含氮物质速率越快[24−25]，所以TVB-N 值越大。另外，温度波动为（−18±0.5）、（−18±1） 和（−18±2）℃组的三文鱼样品的TVB-N 值在冻藏时间5、4 和3 个月时与（−50±0.1） ℃组6 个月时的TVB-N 值相当，并且此时三文鱼样品的TVB-N 值在25 mg N/100 g 以下，可以生食。说明温度波动幅度影响−18 ℃的冻藏时间，减小温度波动至±0.5 ℃，−18 ℃冻藏环境下短期冻藏三文鱼（5 个月以内）可以达到低温冻藏（−50 ℃）三文鱼TVB-N 值的效果，并且−18 ℃的冻藏能耗远低于−50 ℃。

2.2 温度波动对冻藏三文鱼TBARS 值的影响

图2 为三文鱼TBARS 值随冻藏时间的变化关系。TBARS 值用于评估脂质的氧化程度，主要检测由不饱和脂肪酸降解产生的丙二醛含量（Malondialdehyde，MDA）[26]。随着冻藏时间的延长，三文鱼样品的TBARS 值增大。冻藏6 个月期间，（−18±0.5）、（−18±1）和（−18±2）℃组三文鱼样品的TBARS 值从相同的初始值0.11 mg MDA/kg分别增大到1.65、1.89、1.96 mg MDA/kg。这是由于随着冻藏时间的延长，脂质的氧化分解产物，如醛、酮、脂肪酸等具有令人难以接受的气味物质不断积累，使TBARS 值越来越大。

由图2 还可知，冻藏的温度波动幅度显著影响三文鱼的TBARS 值。温度波动越大，冰晶增长程度越大，对肌肉组织细胞造成机械损伤程度越大，各种破裂的细胞器释放出的氧化酶和脂肪氧化的前提物质特别是铁离子越多，加剧了脂质的氧化，次级氧化产物不断积累，表现为丙二醛的检测含量多，所以温度波动幅度越大，TBARS 值越大[25]。（−18±0.5）℃冻藏3 个月左右的三文鱼样品的TBARS 值与（−50±0.1）℃三文鱼样品冻藏6 个月时的TBARS 值基本相同。

图2 三文鱼TBARS 值变化Fig.2 Changes in TBARS of salmon

2.3 温度波动对冻藏三文鱼K 值的影响

K 值是评价鱼类新鲜度的指标，K 值越大，说明三文鱼越不新鲜，一般认为K 值在20%以下为可生食标准，K 值达到60%不适宜食用[16]。

冻藏期间K 值不断增加，冻藏环境的温度波动幅度显著影响K 值增长（图3）。冻藏三文鱼样品的初始K 值为9.87%，6 个月后，（−18±0.5）、（−18±1）、（−18±2）℃冻藏环境下K 值分别增大至43.28%、55.38%、63.54%。（−18±0.5）、（−18±1）、（−18±2）℃组三文鱼样品的K 值分别在冻藏5 个月时、4 个月时、3 个月时与（−50±0.1）℃组6 个月时的K 值相当。该结果表明，−18 ℃冻藏环境条件下减小温差波动、缩短冻藏时间可达到（−50±0.1）℃的冻藏效果。冻藏期间温度波动越大，冰晶重结晶现象越明显，细胞结构破坏，导致肌苷酸（inosine monphonsphate， IMP） 下 降 速 率 增 大 以 及 次 黄 嘌 呤（hypoxanthine，Hx）不断积累[27−28]，K 值增大。由图3可以看出，虽然（−18±0.5）℃组的三文鱼样品的K 值在5 个月时与（−50±0.1）℃组6 个月时的K 值相当，但是此时K 值大于20%；而在3 个月内，（−18±0.5）℃组的三文鱼样品的K 值在20%以下，所以在保证三文鱼样品K 值品质的前提下，冻藏时间为3 个月内时，减小温度波动幅度至±0.5 ℃，可以将冻藏温度从−50 ℃提高至−18 ℃。

图3 三文鱼K 值变化Fig.3 Changes in K value of salmon

2.4 温度波动对三文鱼持水力的影响

持水力能直接反映肌肉抑制水分流失的能力[29]。图4 为冻藏期间三文鱼持水力的变化。冻藏6 个月时，（−18±0.5）、（−18±1）、（−18±2）℃组三文鱼样品的持水力从初始的86.31%分别下降至57.16%、53.49%和51.67%，温度波动越大，三文鱼样品持水力下降的程度越大，温度波动减小至±0.5 ℃时，（−18±0.5）℃组三文鱼样品的持水力冻藏5 个月时与（−50±0.1） ℃组冻藏6 个月时的持水力相当。生产上，通过减小温度波动幅度至±0.5 ℃以内，短期内可将三文鱼的冻藏温度从−50 ℃提高至−18 ℃。随着冻藏时间的延长以及温度波动存在，冻融循环使得冰晶不断增大，导致肌原纤维蛋白失水变性，对肌肉组织细胞造成机械损伤，造成大量汁液流失[30]，持水力下降。

图4 三文鱼持水力变化Fig.4 Changes in water holding capacity of salmon

2.5 水分迁移变化

图5 三文鱼样品T2 分布Fig.5 T2 distribution in transverse relaxation time of salmon

表1 为利用LF-NMR 技术测得的三文鱼水分弛豫时间变化情况。由表1 可以看出，温度波动组T2b随着冻藏时间的延长变化较小，这是由于结合水是与蛋白质紧密结合的水分子，冻融循环不易使其与蛋白质解离；T21随着冻藏时间的延长而减小，这是因为冻融循环使得冰晶长大，肌原纤维蛋白的空间结构发生变化，蛋白质持水性变差，不易流动水的移动性降低；T22呈现先减小后增大的趋势，与李玫等[34]的实验结果一致。与（−50±0.1) ℃对照组的T2b、T21、T22相比，（−18±2）℃组的三文鱼样品在冻藏6 个月期间的T2b、T21、T22三种弛豫时间均极显著减小（P<0.01），(−18±1) ℃组冻藏三文鱼的T2b、T21、T22均显著减小（P<0.05），（−18±0.5）℃组冻藏三文鱼的T2b、T21、T22均差异不显著（P>0.05）。所以温度波动越大，对自由水、不易流动水及结合水的影响越大，其中结合水不易解离或蒸发，不易受肌肉蛋白质结构以及电荷变化的影响，即温度波动对结合水的影响最小。

表1 温度波动对三文鱼横向弛豫时间的影响Table 1 The effect of temperature fluctuation on the transverse relaxation time and water content of salmon

2.6 相关性分析

表2 所示为三文鱼各项化学品质指标的相关性。表中数据有正有负，表示各项指标之间存在正相关或负相关。每个数据的绝对值大小代表两项化学指标的相关性强弱，数据越大，越接近于1，代表两项化学指标相关性越强。

表2 三文鱼样品各品质指标间的相关性分析Table 2 Correlation analysis of quality indexes of salmon samples

TBARS 值与K 值之间的相关系数为0.904，TBARS 值与TVB-N 值之间的相关系数为0.817，TVB-N 值与K 值的相关系数为0.885，可以看出三项化学指标两两互相呈强正相关。表明冻藏三文鱼的各项品质指标都不是独立存在的，各项化学品质指标在冻藏时间、冻藏温度和冻藏温度波动幅度等因素的共同影响下，导致三文鱼发生肌肉纤维松散、蛋白质变性、含氮物质增多、脂质氧化以及持水力下降等变化。特别是在温度波动组中，在反复的冻融循环的影响下，三文鱼的各项化学品质指标及持水力劣化更为严重。

三文鱼样品的水分弛豫时间与三项化学指标均呈较强的负相关，表示随着冻藏时间的延长以及冻融循环的延续，T2b、T21和T22整体呈减小趋势，持水力下降；K 值、TVB-N 值和TBARS 值呈不同程度的增大，蛋白质、脂质及新鲜度劣化。T2b与三项化学指标相关性最强，其中与TVB-N 值相关性达到0.857。这是由于随着冻藏时间的延长，在酶和细菌的作用下蛋白质分解产生氨及胺类等碱性含氮物质不断积累，TVB-N 值不断增大，与蛋白质紧密结合的结合水呈减少趋势，二者共同反映冻藏过程中蛋白质的腐败程度。

2.7 持水力的多元线性回归拟合方程

对三文鱼的持水力通过Origin 软件进行二因素方差分析，随着冻藏时间的延长，在不同的温度波动幅度之间三文鱼的持水力有显著差异（P<0.05）。自变量为冻藏时间和温度波动幅度（实验中为0.5、1、2 ℃），因变量为持水力，采用MATLAB 软件建立了多元线性回归拟合方程（4）：

式中：y 为持水力，%；ΔT 为温度波动幅度，℃；t 为冻藏时间，月。

表3 为对拟合方程的验证。可以看出拟合结果与实验结果平均相差1.0%以下，拟合方程准确可靠，为建立货架期预测提供依据。

表3 拟合方程结果验证Table 3 Verification of the result of the fitting equation

3 结论

冻藏（−50、−18 ℃）6 个月期间，温度波动越大，三文鱼TVB-N 值、TBARS 值和K 值等化学指标值上升越剧烈，持水力下降趋势越明显。三文鱼样品的TVB-N 值、TBARS 值及K 值之间两两互相呈强正相关，三项弛豫时间与三项化学指标呈较强负相关。随着三文鱼冻藏时间的延长，在不同的冻藏温度（−18 、−50 ℃）及温度波动幅度范围（±0.5、±1、±2 ℃）之间持水力有显著差异（P<0.05）。

在保证三文鱼各项化学指标及持水力品质的前提下，在3 个月短期冻藏期间，将温度波动幅度减小至±0.5 ℃，可以将三文鱼的冻藏温度从−50 ℃提高至−18 ℃，从而降低能耗，节约建设与运行成本。