无糖藜麦发酵乳复合发酵工艺优化及品质分析

张 裕，王 颖,2,3,4,*，李志芳，王 迪，张艳莉，佐兆杭

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆 163319；2.国家杂粮工程技术研究中心，黑龙江大庆 163319；3.粮食副产物加工与利用教育部工程研究中心，黑龙江大庆 163319；4.黑龙江省农产品加工与质量安全重点实验室，黑龙江大庆 163319）

藜麦（Chenopodium quinoa），是全营养完全蛋白的功能性食品[1]，2013 年被FAO 认定为最适合人类食用的“超级谷物”，我国目前也是全球设立的5 个宣传点之一[2−4]。藜麦种子中不仅富含脂肪酸、维生素、矿物质、膳食纤维和蛋白质与氨基酸[5−7]，还有大量生物活性化合物，如类胡萝卜素、维生素C 和酚类化合物等[8]，表现出显著的降血糖、抗氧化、减脂、缓解炎症、降低心血管疾病发生的风险等益生功能，使得藜麦作为备受瞩目的新兴营养功能食品之一[9]。藜麦作为低GI 食物原料，长期食用可以控制体重，不会引起人体内血糖浓度的快速升高，在临床上被推荐给糖尿病患者食用[10]。藜麦经乳酸菌发酵代谢产生超氧化物歧化酶（SOD 酶）、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等多功效酶类，其中SOD 酶是机体内能够清除超氧阴离子自由基的预防型抗氧化剂，可直接用于衡量机体抗氧化能力强弱[11]。

杂粮发酵乳是以杂粮与生牛乳或复原乳为主料，经乳酸菌发酵制成具有特殊风味且富含益生活性的乳制品[12]，不仅能保留原材料中固有营养活性成分，还兼具多种乳酸与活性益生菌，具有促进营养物质吸收、维持肠道菌群平衡、缓解乳糖不耐症、提高免疫力等生理功能[13−14]，极大满足消费者对新型杂粮产品的需求。目前魏艳丽等[15]优化藜麦青稞复合酸奶发酵工艺，藜麦添加量15%、青稞5%、发酵温度40 ℃、发酵时间6 h 时，制备的藜麦青稞复合酸奶感官品质较高。李翔等[16]探索藜麦核桃酸奶发酵工艺，藜麦浆20.9%、蔗糖添加量7.0%、菌种接种量3.3%、发酵时间6.1 h，藜麦核桃酸奶感官评分高达95.98。但现阶段研发的藜麦发酵乳多用蔗糖调味，长期饮用不利于机体健康。基于此，本研究将藜麦浆添加到复原乳中，采用木糖醇代替蔗糖，以复合菌系混合发酵，以SOD 酶作为主要考察指标响应面优化无糖藜麦发酵乳发酵工艺，为后续验证此产品的抗氧化活性提供一定的数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

藜麦 青海高原红藜麦；脱脂奶粉 黑龙江双城雀巢有限公司；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum,LP）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus,LA） 东北农业大学菌库；SOD 酶活力检测试剂盒南京建成生物工程研究所。

BS224S 型电子天平 赛多利斯科学仪器有限公司；HDJ-ZTG 型龙多功能电热锅 佛山市亿用电器科技有限公司；JYL-Y912 型打浆机 九阳股份有限公司；pHS-3C 型pH 计 上海精密科学仪器有限公司；均质机 上海人和科学仪器有限公司；DGG-9140A 型电热鼓风干燥箱 上海森信实验仪器有限公司；YXQ-LS-100A 型立式压力蒸汽灭菌器 山东浩中化工科技有限公司；FCH-900B 型超净无菌工作台 北京亚泰科隆仪器技术有限公司；DRP-9082 型电热恒温培养箱 上海森信实验仪器有限公司；A360 型紫外可见分光光度计 上海翱艺仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 制作工艺流程

1.2.2 操作要点 菌种活化：MRS 液体培养基活化受试菌株，传代3 次活化充分。挑取斜面培养基生长较好的菌落接种至MRS 液体培养基中37 ℃培养24 h，于4 ℃冰箱保存备用。藜麦浆制备：挑选籽粒饱满、颜色均匀的红藜麦，反复清洗2～3 遍，蒸锅熟化40～50 min，按1:5（g/mL）料水比充分磨匀藜麦制成藜麦浆，过200 目筛，于4 ℃保存备用。复原乳制备：将脱脂乳粉25 g 加入180 mL 70 ℃蒸馏水，混合均匀。均质：将藜麦浆、木糖醇和复原乳按比例混合预热至70 ℃，20 MPa 均质8 min。灭菌：95 ℃，高压灭菌10 min。冷却后熟：发酵样品立即放入4 ℃冰箱后熟10 h 以上，即得无糖藜麦发酵乳。

1.2.3 复合菌种发酵比例对发酵乳pH 和活菌数的影响 选用LP 和LA 作为发酵菌种复合发酵（LP:LA 为1:3、1:2、1:1、2:1、3:1），以发酵乳pH和活菌数为衡量指标，确定最佳复合发酵剂比例。

1.2.4 木糖醇添加量对发酵乳品质的影响 添加不同含量的木糖醇（3%、4%、5%、6%、7%），对发酵乳进行色泽、气味、口感、组织形态等综合感官评价，以确定最佳木糖醇添加量。

1.2.5 单因素实验

1.2.5.1 藜麦浆添加量对发酵乳SOD 活力影响 设定接菌量3%、发酵温度为38 ℃、发酵时间为8 h，考察不同藜麦浆添加量（10%、20%、30%、40%、50%）对无糖藜麦发酵乳的SOD 酶活力的影响。

1.2.5.2 乳酸菌接种量对发酵乳SOD 酶活力影响设定藜麦添加量为30%、发酵温度为38 ℃、发酵时间为8 h，考察不同接菌量（1%、2%、3%、4%、5%）对无糖藜麦发酵乳的SOD 酶活力的影响。

1.2.5.3 发酵温度对发酵乳SOD 酶活力的影响 设定藜麦添加量为30%、接菌量为3%、发酵时间为8 h，考察不同发酵温度（34、36、38、40、42 ℃）对无糖藜麦发酵乳的SOD 酶活力的影响。

1.2.5.4 发酵时间对发酵乳SOD 酶活力的影响 设定藜麦添加量为30%、接菌量为4%、发酵温度为38 ℃，考察不同发酵时间（6、8、10、12、14 h）对无糖藜麦发酵乳的SOD 酶活力的影响。

1.2.6 响应面优化试验设计 利用Design-Expert 8.06 软件中Box-Behnken 模型，以菌种接种量（A）、藜麦浆添加量（B）、发酵温度（C）、发酵时间（D）4 个单因素为自变量，发酵乳SOD 酶活力为响应值，优化发酵工艺参数，试验设计因素与水平见表1。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface experiment

1.2.7 pH 的测定 采用pH 计对发酵乳进行测定。

1.2.8 活菌数的测定 在无菌操作台内吸取1 mL样品，用灭菌后的生理盐水将样品以1:9 的比例稀释至10n，选取3 个合适的稀释梯度，吸取1 mL 的样品稀释液加入MRS 固体培养基中，混匀，待培养基凝固后放置于37 ℃培养箱中培养24 h，选择菌总数在30～300 之间进行计数[17]。

1.2.9 理化指标的测定 蛋白质含量测定按照国标GB 5009.5-2010 中的方法执行[18]；脂肪含量测定按照国标GB 5413.3-2010 中的方法执行[19]；非脂乳固体测定按照国标GB 5413.39-2010 中的方法执行[20]；酸度的测定按照GB 5413.34-2010 中的方法测定[21]。

1.2.10 微生物的测定 按照GB 4789-2016《食品微生物学检验》测定发酵乳中大肠菌群、致病菌数和乳酸菌数[22]。

1.2.11 感官评分标准 参照赵延胜等[23]的方法，对无糖藜麦发酵乳进行感官评分，参评人数10 人，取平均分作为感官评分，评分标准如表2 所示。

表2 感官评分准则Table 2 Sensory rating criteria

1.3 数据处理

每个样品均进行3 次重复操作，所有数据用x¯±s 表示。用Excel 软件进行数据的录入与处理，响应面分析结果用Design Expert 8.06 软件进行数据分析及方差分析。

2 结果与分析

2.1 复合发酵剂比例对发酵乳pH 和活菌数的影响

LP 属于同型发酵乳酸菌[24]，繁殖能力较强且能大量的产酸，而LA 具有较强的酸耐受性[25]，两种菌株复配为得到一种有较强生长活性、产酸较快的复合发酵剂。从图1 可知，随LP 接种比例的增大，发酵乳pH 逐渐降低，推测随LP 产酸量较大，其接种比例越多，发酵乳中酸度越高。LP 和LA 以2:1 比例复配时，发酵乳中活菌数最高达6.54×109CFU/mL随后下降，推测可能是发酵乳内部环境酸度过高，导致菌株生长繁殖受到一定的抑制，使菌株活菌数减少，且发酵乳酸度过高，口感不易被消费者接受，因此选复合发酵剂比例2:1。

图1 复合发酵剂比例对发酵乳pH 和活菌数的影响Fig.1 Effect of compound starter ratio on pH and viable bacteria count of fermented milk

2.2 木糖醇添加量对发酵乳感官评分的影响

木糖醇添加量直接影响产品的风味口感，由图2可知，发酵乳的感官评分值随木糖醇添加量增加呈现先增加后降低的趋势。木糖醇添加量过少，发酵乳过酸，发酵效果不好，组织状态不稳定。木糖醇添加量过多，发酵乳口感偏甜，感官评分下降。因此木糖醇最适添加量选为5%。

图2 木糖醇添加量对发酵乳感官评分的影响Fig.2 Effect of xylitol supplemental amount on sensory score of fermented milk

2.3 单因素实验

2.3.1 藜麦浆添加量对发酵乳SOD 酶活力及感官评分的影响 由图3a 可知，随藜麦浆添加量的增多，发酵乳SOD 酶活力和感官评分为均呈现先增强后降低的趋势。藜麦浆添加量为30%时，发酵乳SOD 酶活力和感官评分均达最高，这可能是由于混合液中糖类物质恰好促进乳酸菌生长繁殖。藜麦富含的酚类、黄酮类、SOD 酶类活性物质，能够显著抑制脂质过氧化和清除O2-自由基的能力；当藜麦浆过多时，原料难以调配均匀，导致乳酸菌发酵不充分，抗氧化酶系统受损，发酵乳SOD 酶活力下降[26]。因此综合考虑选择藜麦浆添加量最适范围为20%～40%。

图3 单因素实验结果Fig.3 Results of single factor experiment

2.3.2 乳酸菌接种量对发酵乳SOD 酶活力及感官评分的影响 由图3b 可知，随乳酸菌接种量增加，发酵乳SOD 酶活力和感官评分均呈现先升高后下降的趋势。乳酸菌接种量为3%时，发酵乳SOD 酶活力和感官评分均达最高，接种量过低时，发酵乳易污染杂菌形成不利于菌种增殖生长的环境。若接种量超过3%，就可能导致发酵过度发酵乳pH 改变，且过酸、过碱均不利于菌体繁殖生长的环境；同时SOD酶作为蛋白质，分子内部规律性结构亦易受pH、温度等物理或化学因素影响导致氢键断裂进而空间结构被破坏，使其活性降低或衰亡，从而影响SOD 酶活力[27]。因此综合考虑选择乳酸菌接种量最适范围为2%～4%。

2.3.3 发酵温度对发酵乳SOD 酶活力及感官评分的影响 由图3c 可知，随发酵温度增加，发酵乳SOD酶活力和感官评分均呈现先升高后下降的趋势。发酵温度38 ℃时，发酵乳的SOD 酶活力和感官评分最高。发酵温度过低不利于乳酸菌生长，使发酵速度变慢，产生代谢产物不足，SOD 酶活力下降。根据酶促反应动力学，温度升高反应速度加快，呼吸强度增高，导致微生物繁殖代谢加快，但温度升高同时，也会导致酶失活速度增大，缩短发酵周期，影响发酵效果[28]。因此综合考虑选择发酵温度最适范围为36～40 ℃。

2.3.4 发酵时间对发酵乳SOD 酶活力及感官评分的影响 由图3d 可知，随发酵时间增加，发酵乳SOD酶活力和感官评分均呈现先升高后下降的趋势。发酵时间8 h，发酵乳SOD 酶活力和感官评分最高，此时发酵乳气味醇正，口感酸甜合适。推测当发酵时间过短，乳酸菌生长繁殖不充分，代谢产物积累不足，酶活性低；时间过久，乳酸菌生长繁殖所需的营养物质不足，其生长提前进入衰亡期，菌体死亡数增加，发酵乳中代谢废物积累，致使SOD 酶活力迅速下降[29]。因此综合考虑选择发酵时间最适范围为6～10 h。

2.4 响应面实验结果分析

2.4.1 回归模型分析 选取乳酸菌接种量（A）、藜麦浆添加量（B）、发酵温度（C）和发酵时间（D）四个因素作为考察因子，研究各因素间交互作用对发酵乳的SOD 酶活力的影响，采用Box-Behnken 设计原理，对无糖藜麦发酵乳的发酵工艺进行优化，如表3所示。

对表3 中试验数据进行分析，得到响应面回归模拟方程：Y=245.8+1.67A−2.48B+5.57C+3.45D−2.08 AB−1.56AC−5.43AD+7.65BC−5.3BD−2.15CD−25.39 A2−18.54B2−20.21C2−9.98D2。

表3 响应面试验设计与结果Table 3 Experimental design and results for respond surface analysis

对方程进行显著性分析，如表4 所示。所选回归方程模型P<0.0001，说明该二次多项回归模型极显著，失拟项（P=0.1971>0.05），表明不显著，说明该模型吻合实际情况，方程对试验有较好的拟合性。同时，模型回归系数R2为0.9939，校正决定系数R2Adj为0.9877，表明该方程拟合程度良好，试验误差小，可用于无糖藜麦发酵乳发酵工艺的优化。

表4 回归方程方差分析Table 4 Analysis of variance for regression model

由分析结果可知因素一次项中C、D 对无糖藜麦发酵乳SOD 酶活力的影响达到高度显著水平（P<0.001），A、B 项达到差异极显著（P<0.01），由因素的F值可知，各因素对无糖藜麦发酵乳SOD 酶活力影响顺序依次为：发酵温度>发酵时间>藜麦浆添加量>乳酸菌接种量。

2.4.2 响应面分析 依据Design-Expert，获得各因素之间交互作用对无糖藜麦发酵乳SOD 酶活力影响的响应面三维图，如图4 所示，两个因素之间的相互作用越强曲面图坡度陡峭，反之亦然，因此各交互作用对发酵乳SOD 酶活力的影响从大到小依次为B（藜麦浆添加量）C（发酵温度）>A（乳酸菌接种量）D（发酵时间）>B（藜麦浆添加量）D（发酵时间）>C（发酵温度）D（发酵时间）>A（乳酸菌接种量）B（藜麦浆添加量）>A（乳酸菌接种量）C（发酵温度），其中BC、AD、BD 交互作用对发酵乳SOD 酶活力的影响极显著，这与方差分析结果吻合。根据响应面试验结果分析得到最佳参数乳酸菌接种量3.01%、藜麦浆添加量29.32%、发酵温度38.24 ℃、发酵时间8.35 h、此条件下无糖藜麦发酵乳的SOD 酶活力可达246.54 U/mL。考虑实际操作情况，将最佳工艺参数调整为：乳酸菌接种量3%，藜麦浆添加量30%，发酵温度38 ℃，发酵时间8 h。为验证模型结果的准确性，根据最佳发酵工条件进行三次重复性试验，得到无糖藜麦发酵乳SOD 酶活力为（241.17±3.65） U/mL，与模型预测值接近，说明响应面优化的无糖藜麦发酵乳发酵工艺参数具有准确性。

图4 两因素交互作用对无糖藜麦发酵乳SOD 活力的响应面图Fig.4 Response surface diagram of SOD activity in fermented milk of sugar-free quinoa under the interaction of two factors

2.5 无糖藜麦发酵乳理化指标测定结果

由表5 可知，无糖藜麦发酵乳中蛋白质、脂肪、非脂乳固体、酸度均符合相关国标要求，并且藜麦浆的加入使发酵乳更满足现代人的膳食营养需求。

表5 无糖藜麦发酵乳理化指标测定结果Table 5 Determination of physicochemical indexes of sugar-free quinoa fermented milk

2.6 微生物指标测定结果

对无糖藜麦发酵乳进行微生物指标测定，如表6所示，无糖藜麦发酵乳的乳酸菌数高于普通发酵乳，且未检出大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等致病菌，卫生指标合格，符合国家标准要求。

表6 微生物指标测定结果Table 6 Results of microbial index determination

3 结论

以藜麦浆与脱脂奶粉为原料，利用木糖醇替代蔗糖制得的无糖藜麦发酵乳，通过单因素实验和响应面试验优化最佳发酵工艺条件为：复合发酵剂植物乳杆菌:嗜酸乳杆菌为2:1、木糖醇添加量5%、乳酸菌接种量3%、藜麦浆添加量30%、发酵温度38 ℃、发酵时间8 h，其中发酵温度对发酵乳SOD 酶活力影响最大，此条件下无糖藜麦发酵乳的SOD 酶活力241.17 U/mL，蛋白质含量为2.33 g/100 g，非脂乳固体含量为6.59 g/100 g，酸度为77.9 °T，乳酸菌数为5.85×109CFU/mL，未检出致病菌。无糖藜麦发酵乳组织状态稳定，口感细腻，酸甜适中，具有藜麦香气，是一款营养丰富、具有较高抗氧化能力的杂粮发酵乳，并为深入研究无糖藜麦发酵乳降糖提供理论基础及数据支撑。