两种叶酸偶联物的合成及体外靶向性研究

张文典，崔 杰，夏一帆，张 欣，段少峰*

（1河南大学第一附属医院，开封457001；2河南大学药学院，开封457001）

肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，由于其恶性程度高和易产生抗药性，临床常用化学药物治疗遇到了种种困难，如药物毒性、药物分布不规则、药物溶解度小、体内半衰期短等等。研究人员一直致力于研发更为精准有效的治疗方法，利用纳米材料靶向递送药物就是研究热点之一［1-2］。

叶酸在靶向递送系统中是一个非常具有潜力的配体。叶酸受体在大多数人体正常组织极少表达，而在多种人类肿瘤细胞例如乳腺癌、肺癌、宫颈癌、肝癌、鼻咽癌等肿瘤细胞中存在过度表达，叶酸与叶酸受体具有高亲和力，因此以叶酸为靶向分子的药物递送系统可以经叶酸受体介导的细胞内吞作用而呈现出特定的靶向性。此外，叶酸也因其可应用性强、高稳定性和无免疫原性而被研究者广泛关注［3］。Yen等［4］研究发现，用叶酸修饰的金纳米粒在HepG2细胞中的摄取效率远高于无叶酸修饰的金纳米粒。Yang等［5］研究发现，由Folate-PEG3000-PLA2000制备的叶酸靶向姜黄素胶束对MCF-7和HepG2细胞的入胞效率和体外细胞毒性显著增强。Yuan等［6］通过在石墨烯纳米复合物（GGMPN）上连接单抗P-糖蛋白（P-gp）抗体、叶酸（FA）和miR-122制备的金纳米粒子联合递送系统，具有药物靶向性和控释特性，能够显著促进耐药HepG2细胞凋亡。

脂质体作为一种经典的药物递送系统，其具有载药性能强、实用性好、生物相容性好、完全生物降解性、无毒性、无免疫原性和可以控制药物释放等众多优势，这使其在药物载体的制备中的应用备受关注［7-9］。研究者对脂质体进行了诸多改造，研究发现利用聚乙二醇（PEG）和叶酸对脂质体表面进行化学修饰，可以使脂质体通过叶酸受体介导的内吞作用，达到靶向递送药物的目的［10］。然而在对脂质体结构进行靶向性设计时，PEG的相对分子质量、链长、构象、覆盖度等都会对递送效率产生影响，因此在设计含PEG的配方时，需要仔细考虑这些因素［11］。为了探索能够实现肝癌靶向递送的叶酸偶联物，本研究将叶酸、胆固醇琥珀酸单酯与不同相对分子质量的PEG材料连接，合成了两种叶酸-聚乙二醇-胆固醇琥珀酸单酯Folate-PEG-CHEMS材料（Folate-PEG2000-CHEMS和Folate-PEG4000-CHEMS），Folate-PEG-CHEMS材 料的结构特点使其具有较好的稳定性和两亲性，在靶向递送药物至肝癌细胞方面的应用潜力值得探索。利用核磁共振氢谱氢谱（1H NMR）和超高分辨率复杂体分离鉴定质谱系统对终产物进行了表征。将两者应用于脂质体制备，以钙黄绿素为荧光标记，制备了钙黄绿素脂质体，通过体外细胞摄取实验评价Folate-PEG2000-CHEMS和Folate-PEG4000-CHEMS在脂质体药物递送所起到的作用。

1 材料

1.1 药品与试剂

钙黄绿素（calcein）、胆固醇琥珀酸单酯（cho‐lesteryl hemisuccinate，CHEMS）、聚 氧 乙 烯 二 胺MW2000 D（H2N-PEG2000-NH2）、聚氧乙烯二胺MW4000 D（H2N-PEG4000-NH2）均购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；胆固醇（cholesterol，BBI life sciences corporation）；氢化大豆磷脂（HSPC）、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺DSPE-PEG2000均购置于上海艾韦特医药科技有限公司；叶酸（folic acid，FA，百灵威科技有限公司）；Sephadex G-25凝胶、CL-4B凝胶（上海源叶生物科技有限公司）；RPMI 1640（美国Sigma-aldrich公司）；胎牛血清（FBS，浙江天杭生物科技股份有限公司）；其他试剂均为市售分析纯。

1.2仪器

ZEN3690激光粒度仪（英国马尔文公司）；UV-2000型紫外可见分光光度计［尤尼柯（上海）仪器有限公司］；超高分辨率复杂体分离鉴定质谱系统（Q Exactive Plus，美国赛默飞世尔科技有限公司）；Ziss 880型激光共聚焦扫描显微镜（德国卡尔·蔡司股份公司）；CytoFLEX型流式细胞仪［贝克曼库尔特生物科技（苏州）有限公司］。

2 方 法

2.1 叶酸-聚乙二醇-胆固醇琥珀酸单酯(Folate-PEG-CHEMS)的合成

2.1.1 叶酸-聚乙二醇-胺(Folate-PEG-amine)的合成 将叶酸0.06 mmol溶于DMSO 1 mL，后依次加入EDC 0.08 mmol、NHS 0.07 mmol以及三乙醇胺34.8µL，通入氩气保护，室温避光搅拌反应约1 h，加入H2N-PEG2000-NH2或H2N-PEG4000-NH20.05 mmol，避光搅拌过夜。加入Na2CO3水溶液（50 mmol/L）5 mL，于20 000 r/min离心后去除不溶物，将剩余溶液过Sephadex G-25葡聚糖凝胶柱，去除未反应的小分子副产物，纯化后的溶液冷冻干燥24 h，得黄色蓬松固体。

2.1.2 胆固醇琥珀酸单酯活化物(CHEMS-NHS)的合成 将CHEMS 1 mmol、NHS 2 mmol共溶于四氢呋喃10 mL中，取DCC 3.2 mmol溶于四氢呋喃5 mL中，将两溶液混合后室温搅拌过夜。将反应液过滤弃滤渣，将滤液转移至梨形瓶中，35℃水浴下，减压旋蒸除尽溶剂四氢呋喃，残余物以异丙醇和四氢呋喃混合溶液溶解后重结晶，将重结晶产物真空干燥24 h，得白色粉状固体。

2.1.3 叶酸-聚乙二醇-胆固醇琥珀酸单酯(Folate-PEG-CHEMS)的合成 将Folate-PEGamine 20µmol、CHEMS-NHS 50µmol共溶于氯仿50 mL中，室温下避光搅拌过夜。反应结束后，35℃水浴下，减压旋蒸除尽溶剂氯仿，残余物加入NaCO3水溶液（50 mmol/L）5 mL，室温下水化30 min，再于20 000 r/min离心10 min后，将上清液转移入8 kD透析袋于蒸馏水中透析72 h纯化产物，透析后产物冷冻干燥48 h，得黄色蓬松固体。

2.2 叶酸-聚乙二醇-胆固醇琥珀酸单酯的表征

2.2.11H NMR表征 分别称取FA-PEG2000-CHEMS和FA-PEG4000-CHEMS各5 mg，以CDCl3为溶剂将产物溶解，利用核磁共振仪进行1H NMR表征。

2.2.2 质谱表征 分别取适量FA-PEG2000-CHEMS和FA-PEG4000-CHEMS溶于甲醇1 mL，过滤后，利用超高分辨率复杂体分离鉴定质谱系统分析产物，对终产物进行结构验证。

2.3 脂质体的制备与表征

2.3.1 钙黄绿素脂质体的制备 本研究采用薄膜分散水化法制备钙黄绿素脂质体。首先合成靶向脂质体，按物质的量比55∶40∶4.5∶0.5称取HSPC/CHOL/DSPE-PEG2000/FA-PEG2000-CHEMS（或FA-PEG4000-CHEMS）置于梨形瓶中，溶于适量氯仿，置于旋转蒸发仪上，于37℃减压旋转蒸发约1 h，后加入适量钙黄绿素水溶液（250 mmol/L）与PBS（pH 7.4），60℃水化约30 min，经过450 nm、220 nm薄膜各5次进行整粒。以PBS（pH 7.4）为洗脱剂，过CL-4B琼脂糖凝胶柱分离纯化脂质体，即得叶酸靶向钙黄绿素脂质体（FA-PEG2000-L与FA-PEG4000-L）。非靶向钙黄绿素脂质体（C-L）的制备同上，仅不加FA-PEG2000-CHEMS或FAPEG4000-CHEMS。

2.3.2 钙黄绿素浓度的测定 样品中钙黄绿素的质量浓度利用紫外分光光度法计算而得，检测波长为491 nm。配制质量浓度为1，2，3，5，8µg/mL的钙黄绿素水溶液，测定各浓度吸收度，绘制标准曲线。

2.3.3 钙黄绿素脂质体包封率的测定 取纯化后钙黄绿素脂质体100µL，加入10%Triton X-100 100µL，超声振荡破膜，利用紫外分光光度法测定脂质体中药物含量，计算包封率（%，脂质体中药物含量/总投料量×100）。

2.3.4 平均粒径、分散系数(PDI)和Zeta电位的测定 取适量脂质体，用适量PBS（pH 7.4）稀释后，采用激光粒度仪测定脂质体粒径、分散系数和Zeta电位。

2.4 脂质体的体外细胞摄取实验

FA-PEG2000-CHEMS和FA-PEG4000-CHEMS靶向递送效率通过体外细胞摄取实验来评价。

2.4.1 HepG2细胞的培养 HepG2细胞培养瓶中加入含有1%青霉素链霉素和10%FBS的无叶酸RPMI 1640培养基，置于37℃，5%CO2的培养箱中培养。取处于对数生长期的细胞用于体外细胞摄取实验。

2.4.2 体外细胞摄取实验 取对数生长期HepG2细胞经胰酶消化为混悬状态后转移入无菌离心管中，1 000 r/min离心5 min，离心后的细胞溶液弃去上清液，加入新鲜培养基，等份分装入4个无菌EP管中。空白组不做加药处理，给药组分别加入非靶向钙黄绿素脂质体（C-L）或靶向钙黄绿素脂质体（FA-PEG2000-L或FA-PEG4000-L），37℃下孵育1 h。孵育结束后，将细胞用冷的PBS洗3遍以除去未结合的脂质体。利用激光共聚焦扫描显微镜或流式细胞仪检测HepG2细胞内荧光强度。

2.5 统计分析

采用GraphPad Prism 5软件对实验数据进行描述性统计，计量资料结果以xˉ±s表示，两组之间比较选用t检验和方差分析，P＜0.05表明差异有统计学意义。

3 结果

3.1 叶酸-聚乙二醇-胆固醇琥珀酸单酯的合成

叶酸、胆固醇琥珀酸单酯结构上含有羧基，聚氧乙烯二胺分子两端为氨基。本研究以酰胺反应为合成基础，以EDC和NHS为催化剂，分别合成叶酸-聚乙二醇-胺（Folate-PEG-amine）和胆固醇琥珀酸单酯活化物（CHEMS-NHS），将两者反应后，成功将叶酸、胆固醇琥珀酸单酯接枝到PEG上，合成了叶酸-聚乙二醇-胆固醇琥珀酸单酯（FA-PEG2000-CHEMS和FA-PEG4000-CHEMS），合成路线如图1所示。

Figure 1 Synthesis of Folate-PEG-CHEMSCHEMS:Cholesteryl hemisuccinate;FA:Folic acid

3.2 1H NMR图谱解析

聚氧乙烯二胺（H2N-PEG-NH2）、胆固醇琥珀酸单酯（CHEMS）、叶酸（FA）和叶酸-聚乙二醇-胆固醇琥珀酸单酯（Folate-PEG-CHEMS）的1H NMR图谱如图2所示。图2-B为CHEMS的1H NMR图谱，δ7.26为溶剂（CDCl3）峰，δ5.38为CHEMS的烯烃质子峰，δ0.69~2.21是胆固醇脂肪族的质子峰，δ2.60~2.67为CHEMS上琥珀酸（-CH2-CH2）质子峰。图2-A为H2N-PEG-NH2核磁氢谱图，δ7.26为溶剂（CDCl3）峰，δ3.5~3.7为H2N-PEG-NH2重复单元（-CH2-CH2-O-）。与图2-A、C相比较，图2-D中Folate-PEG-CHEMS偶联物1H NMR结果显示δ3.54~3.67处出现了较强的峰，H2N-PEG-NH2重复单元（-CH2-CH2-O-），除了为H2N-PEG-NH2峰外，在δ8.64、7.72、6.67、6.56（图中放大部分）处出现了叶酸结构上（-CH）的质子信号峰，此为叶酸的特征信号峰，由此推断Folate-PEG-CHEMS已成功合成。

3.3 质谱图谱解析

Figure 2 1H NMR spectra of NH2-PEG4000-NH2(A),CHEMS(B),Folate-PEG-CHEMS(D)in CDCl3 and folic acid(C)in DMSO

本研究中所用聚乙二醇（PEG）相对分子质量分别约为2 000、4 000，终产物FA-PEG2000-CHEMS和FA-PEG4000-CHEMS的理论平均相对分子质量分别约为2 891、4 891。从图3质谱分析结果可看到FA-PEG2000-CHEMS和FA-PEG4000-CHEMS相对分子质量为2 891、4 823，与所合成终产物的理论相对分子质量基本吻合，从而证实所合成的高分子聚合物为所需要的目标化合物。

3.4 钙黄绿素脂质体的包封率

钙黄绿素质量浓度在1~8µg/mL呈现良好的线性关系。其线性回归方程为A=0.051c-0.006 8，R2=0.999 1。计算得钙黄绿素脂质体包封率为（15.6±5.1）%。

Figure 3 MS spectra of FA-PEG2000-CHEMS(A)and FA-PEG4000-CHEMS(B)

3.5 平均粒径、分散系数(PDI)和Zeta电位

采用激光粒度仪测定各项指标。测得钙黄绿素脂质体的平均粒径为（205.8±10.2）nm，分散系数（PDI）为0.146±0.09。经电位分析仪测试脂质体的Zeta电位为-（1.19±0.31）mV。靶向组脂质体与非靶向脂质体粒径分布及Zeta电位表征无显著性差异。

3.6 体外细胞摄取实验

钙黄绿素脂质体在肝癌HepG2中的靶向性研究通过体外细胞摄取实验进行评价。激光共聚焦扫描显微镜分析体外HepG2细胞摄取钙黄绿素荧光结果如图4所示，非靶向脂质体组（图4-B）与FA-PEG2000-L组（图4-C）HepG2细胞中呈现出微弱荧光，说明非靶向脂质体与FA-PEG2000-L摄取效率低，未能在该实验条件下成功递送药物。图4-D为靶向脂质体FA-PEG4000-L在HepG2细胞中的摄取情况，结果显示HepG2细胞内有明显的钙黄绿素绿色荧光，且强度高于其他组。流式细胞术的定量分析结果如图5、图6所示，普通钙黄绿素脂质体（C-L）组、FA-PEG2000-L组、FA-PEG4000-L靶向脂质体组内荧光强度与对照组（Blank）相比均具有显著性差异（P＜0.01），C-L组与FA-PEG2000-L组荧光强度相比无显著性差异（P＞0.05），表明叶酸偶联物FA-PEG2000-CHEMS不能够提升HepG2细胞对药物的摄取效率。然而，FA-PEG4000-L靶向脂质体组的荧光强度值分别约为C-L组与FA-PEG2000-L组的3.6和3.1倍，差异均有统计学意义（P＜0.01），说明FA-PEG4000-L靶向脂质体能提升HepG2细胞对药物的摄取效率，叶酸偶联物FA-PEG4000-CHEMS有助于提高脂质体在HepG2细胞中的入胞能力。

4 讨论

Figure 4 Fluorescence images of cellular uptake in HepG2 cellsA:Blank;B-D:HepG2 cells treated with non-targeted calcein liposome(C-L),FA-PEG2000-L or FA-PEG4000-L(D)at 37°C for 1 hour,respec‐tively

脂质体技术良好的市场前景和技术性能已使其成为制药、生物技术、免疫调节、遗传工程、基因药物等研究领域的热点［12-13］。脂质体技术的临床应用潜力令人瞩目，Patisiran阳离子脂质体注射液作为全球第一款siRNA药物于2018年获批上市［14］。脂质体由磷脂和适当的附加剂组成，磷脂和胆固醇是形成脂质体双分子层的基础物质，两者也是天然脂蛋白和生物膜的组成成分，因此具有高度的生物相容性，含有靶向基团结构修饰的脂质体可以用于靶向特定的细胞群［15］。叶酸脂质体是一种受体靶向型药物递送系统，通常由亲水性直链高分子将叶酸分子与脂质体表面联接起来而获得［16］。

本研究以叶酸为靶向分子，以亲水链H2NPEG-NH2（H2N-PEG2000-NH2或H2N-PEG4000-NH2）为主体，一端氨基与一分子叶酸经碳二亚胺类脱水剂EDC催化发生偶联反应，得到单端叶酸修饰亲水链段FA-PEG-NH2，疏水分子胆固醇琥珀酸单酯通过DCC脱水剂催化得到CHEMS-NHS活性酯，进一步与FA-PEG-NH2缩合得到叶酸靶向两亲性分子叶酸-聚乙二醇-胆固醇琥珀酸单酯（FA-PEG2000-CHEMS与FA-PEG4000-CHEMS），其侧链为酰氨键和酯键，水解稳定性较好，同时，原料成本低且合成工艺简单。利用核磁共振氢谱及高分辨质谱成功验证其结构的正确性。高分子PEG具有亲水性，小分子胆固醇琥珀酸单酯为疏水性，因此，终产物Folate-PEG-CHEMS具有两亲性，可被应用于脂质体制备。

Figure 5 Typical pictures of cellular uptake measured by flow cytometry.HepG2 cells were treated with C-L,FA-PEG2000-L or FA-PEG4000-L at 37°C for 1 hour

Figure 6 Cellular uptake measured by flow cytometry(xˉ±s,n=3)HepG2 cells were treated with C-L,FA-PEG2000-L or FA-PEG4000-L at 37°C for 1 hour**P＜0.01

本研究以钙黄绿素作为荧光标记物，制备了非靶向及叶酸靶向钙黄绿素脂质体，脂质体处方为HSPC/Cholesterol/DSPE-PEG2000/FA-PEG2000-CHEMS（或FA-PEG4000-CHEMS），各组分物质的量比为55∶40∶4.5∶0.5，其主要成分HSPC/CHOL/DSPEPEG2000物质的量占比99.5%，此三者为FDA于1995年批准的第1个PEG化长循环脂质体DOXIL的处方成分，属于经典且安全的脂质体辅料。FAPEG2000-CHEMS或FA-PEG4000-CHEMS物质的的量占比为0.5%，偶联物一端为叶酸，一端为类胆固醇结构，此类胆固醇结构可融入脂质体脂质层，从而将叶酸锚定在脂质体表面。所得钙黄绿素脂质体呈现微弱负电荷，相较于阳离子脂质体、无机纳米粒等药物递送系统，安全性高。在脂质体表面进行PEG修饰有助于载体躲避网状内皮系统的捕获，使脂质体具有长循环的效果，且可在脂质体表面形成水化层，有助于保持脂质体稳定性，然而，PEG修饰对载体的递送也可能会相应产生一定影响［17-18］。本研究发现，使用不同相对分子质量的叶酸PEG偶联物使脂质体在递送效率方面呈现出差异。叶酸受体靶向脂质体分别用两种叶酸偶联物FA-PEG2000-CHEMS与FA-PEG4000-CHEMS合成，用激光共聚焦扫描显微镜及流式细胞术分别定性及定量检测了靶向功能性材料将药物输送至肿瘤细胞内的效果。结果表明，FA-PEG4000-L成功将钙黄绿素递送至肝癌HepG2细胞，且FA-PEG4000-L靶向脂质体组的细胞内荧光强度分别约为普通脂质体组、FA-PEG2000-L组的3.6和3.1倍（P＜0.01），呈现出更高效的递送效率。推测此种情况与PEG链长度有关，叶酸和脂质锚定物之间需要一个基于适宜长度的PEG的间隔物，以实现有效的叶酸受体介导的脂质体靶向肿瘤细胞。

本研究表明，叶酸偶联物FA-PEG2000-CHEMS与FA-PEG4000-CHEMS能够应用于脂质体制备，且FA-PEG4000-CHEMS所制备脂质体FA-PEG4000-L具有相对更强的递送能力。叶酸靶向材料FAPEG4000-CHEMS有助于提升脂质体在肝癌HepG2细胞中的递送效率，且该材料制备简便，可操作性强，具有两亲性，可应用于纳米药物递送系统，应用潜力较大，后续将进一步探索其在靶向递送基因药物治疗肝癌方面的应用。