长枝木霉引发灵芝绿霉病的快速检测体系的建立

李承达 张亚鑫 刘权德 唐玉琴

摘    要：为建立一种由长枝木霉引发灵芝绿霉病的快速检测体系，通过对形态特征及致病性的测定确定病原菌菌株，针对病原菌的特异性基因设计合成引物，对引物进行特异性和灵敏度试验，再对接种过病原菌的土壤进行灵敏度验证。结果表明，病原菌为长枝木霉，设计的引物具有较高的特异性，检测浓度下限为10-2 ng·μL-1;可从含有4.28×106个孢子的1 g土壤中扩增出条带。相比较于传统的检测方法耗时更短，结果检测性高，具有高特异性和灵敏度。

关键词：长枝木霉;灵芝;快速检测

中图分类号：S435.673         文献标识码：A          DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2021.07.014

Abstract： In order to establish a rapid detection system of green mold on Ganoderma lingzhi caused by Trichoderma longibrachiatum，the identification of the pathogen strains was based on determining of morphological and pathogenic characteristics. The study designed and synthesized primers aiming at the specific genes of pathogens， and then carried out specificity and sensitivity tests on the primers. The soil inoculated pathogens were also tested. The results indicated that the pathogen was Trichoderma longibrachiatum. The designed primers have high specificity and the minimum testing concentration was 10-2 ng·μL-1. In the polymerase chain reaction （PCR） for Genomic DNA of soil inoculated pathogens， products occurred in the 1 g soil contained 4.28×106 spores with the designed primers. Compared with the traditional detection methods， the system is more accurate and costs less time.

Key words： Trichoderma longibrachiatum; Ganoderma lingzhi; rapid detection

灵芝（Ganoderma lingzhi）属担子菌门伞菌纲多孔菌目灵芝科[1]。灵芝是我国传统名贵药材，具有多种生理活性和药理作用[2]。中国人工栽培灵芝已有60多年历史， 主要分布在四川、山东、广东、广西、福建、江西、浙江及吉林等地，栽培模式主要以覆土栽培为主[3]。近年来，灵芝市场需求大约每年在以18%～30%的速度增长[4]，2015年我国灵芝栽培面积已达到1万hm2， 灵芝及孢子粉产量约12万t， 产值16亿美元，分别约占全球的75%和30%，已成为世界上灵芝的主要生产和出口国[5]。随着灵芝市场的走俏，其栽培从业者与日俱增，随之发生的病害也作为一个重要的研究方向来开展。灵芝菌丝体生长初期颜色洁白、浓密，绿霉染病初期菌丝体为灰白色、致密，因此早期病害特征肉眼难以辨别。当菌椴颜色逐渐变为浅绿直至深绿色时，轻者导致灵芝减产，重者则绝收。且连作过程中土壤积累的有害微生物导致灵芝老产区绿霉菌源较多，造成灵芝子实体生长缓慢、子实体变小、畸形等现象[6]。因此，要尽量避免重茬地栽培，3年内不宜再次栽培[7]，病害发生严重影响了生产者的积极性。目前对于绿霉病传统的检测方法，存在着检测准确度低、耗时长、环境要求苛刻等缺点[8]。而中国对于灵芝绿霉病分子检测的研究仅见黄鑫伟等[9]2018年中对侧耳木霉进行了快速检测体系的建立。因此，本研究拟建立一種针对于由长枝木霉所引发的灵芝绿霉病的快速检测体系，从而在今后的灵芝栽培和灵芝绿霉病的防治中提供技术支持。

1 材料和方法

1.1 材料

供试 菌株：XU0177—长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）、XU0032—深绿木霉（Trichoderma atroviride）、XU0052—拟康宁木霉（Trichoderma koningiopsis）、XU8130—侧耳木霉（Trichoderma pleuroticola）、XU8074—哈茨木霉（Trichoderma harzianum）均为吉林农业科技学院菌物资源开发与利用实验室分离、鉴定后保藏备用。

试剂及仪器：CTAB、氯仿、异戊醇、异丙醇、无水乙醇，马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g，去离子水定容至1 000 mL。C-96 G基因扩增仪，杭州龙扬科学仪器有限公司;JY 600电泳仪，北京君意东方电泳设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 形态特征及致病性的测定 将保存的菌株XU0177（分离自吉林市左家镇灵芝生产基地灵芝病原木霉）接种在PDA培养基中25 ℃黑暗条件下培养。观察菌落形态以及菌株产色素情况，并在光学显微镜下观察病原菌的分生孢子梗、分生孢子大小、形态等显微特征。菌株致病性的测定方法依据植病研究法[10]进行测定。

1.2.2 RNA polymerase II second largest subunit（rDNA-RPB2）基因序列分析 用改良的CTAB法提取病原菌菌株基因组DNA。扩增引物为fRPB2-5F（GAYGAYMGWGATCAYTTYGG）和bRPB2-7R2（ACYTGRTTRTGRTCNGGRAANGG）[11]，引物均由华大基因科技有限公司合成。50μL PCR反应体系：2× Es Taq MasterMix（Dye）25 μL、10 μmol·L-1上下游引物各1 μL、病原菌菌株基因组DNA模板10 μL、无菌ddH2O 13 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循环30次;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。扩增产物经纯化后， 由华大基因科技有限公司测序，利用MEGA 7.0软件以最大似然法构建系统发育树， 系统树分支的可信度用Bootstrap检测，1 000次重复。

1.2.3 引物设计与合成 将菌株XU0177与其他5种长枝木霉、哈茨木霉、拟康宁木霉、深绿木霉、侧耳木霉的rDNA-RPB2序列进行比对，针对菌株XU0177 通过RPB2所扩增的特异性基因，依据引物设计原则应用Permier 5.0软件设计引物：0177-2-1：5′-CCGAGCTGGCCAACTATTTGAGACGT-3′;0177-2-2：5′-TTCAAGCCGTTGGAGAGCGTGCC-3′，引物特异性初步验证在GeneBank中进行，引物均由华大基因科技有限公司合成。

1.2.4 引物的特异性及灵敏度试验    以菌株XU0177、侧耳木霉、哈茨木霉、拟康宁木霉、深绿木霉的DNA作为特异性试验的模板，与引物0177-2-1/0177-2-2进行特异性验证，50 μL PCR反应体系：2× Es Taq MasterMix（Dye）25 μL、10 μmol·L-1上下游引物各1 μL、病原菌菌株基因组DNA模板10 μL、无菌ddH2O 13 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循环30次;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取6 μL PCR产物与2 μL loading buffer混合，加入到琼脂糖凝胶加样口中，以DNA Mraker作为参照。电压调至恒压100 V，30 min后在凝胶成像系统中观察结果，并拍照保存。试验重复3次。将提取得到的XU0177菌株DNA用无菌ddH2O 10倍梯度稀释至10-1 ，10-2，

10-3，10-4，10-5 ng·μL-1，各取10 μL作为灵敏度检测的模板，用同上述相同的PCR反应体系进行引物灵敏度试验。试验重复3次。

1.2.5 土壤中病原菌的检测 配制4.28×107个·mL-1分生孢子悬浮液，并以10倍浓度梯度连续稀释5次。取1 mL孢子悬液分别与10 g土壤均匀混合，分别获得每克土壤中含有4.28×106，4.28×105，4.28×104，4.28×103，4.28×102个孢子的接种土壤[12]。通过Ezup Column Soil DNA Purification Kit试剂盒（生工生物工程股份有限公司）对土壤微生物基因组DNA进行提取，用同上述相同的PCR反应体系进行引物试验，并结合琼脂糖凝胶电泳来进行分析。

2 结果与分析

2.1 病原菌的形态特征及致病性

菌株XU0177的菌落于25 ℃黑暗条件下在PDA培养基上菌落初期为绿灰色，后期为深绿色;分生孢子堆深绿色，有时有白色的杂斑点。菌落背面初期为无色，后期由于菌株产生黄色的可扩散性色素，导致背面成黄色（图1—图2）。分生孢子椭圆形至细长椭圆形，大小为3.2～5.3 μm × 2.2～3.5 μm。致病性的结果与Zhang等[13]2019年研究结果相一致。初步确定该病原菌为长枝木霉。基于菌株XU0177的rDNA-RPB2基因序列构建系统发育树，发现与长枝木霉序列同源性为100%，聚为一支，最终确定菌株XU0177为长枝木霉（图3）。

2.2 特异性试验

根据特异性验证结果表明， 设计的引物0177-2-1/0177-2-2具有高度的特异性， 仅菌株XU0177 DNA模板的反应中扩增出大小为98 bp的特异性目的条带（图4）， 而其他5种常见导致灵芝绿霉病的菌株均未出现特异性条带。

2.3 灵敏度试验

灵敏度试验结果表明，将模板DNA稀释至10-1，

10-2 ng·μL-1后仍能扩增出目的性条带，虽有少量杂带出现，但通过只添加引物的对照性试验和胶回收处理可知，少量杂带的出现并非是引物二聚体引起的，可能是因为小分子的存在，所以该研究检测浓度的下限为10-2 ng·μL-1（图5）。

2.4 土壤中病原菌的检测

采用人工接种的土壤样本对已建立的PCR检测体系进行有效性及灵敏度验证，每克土壤中含有4.28×106个孢子时引物能扩增出条带，而在其他的土壤样本中未见扩增条带。由此可知，该引物对土壤中长枝木霉孢子检测灵敏度为4.28×106个· g-1（图6）。3 结论与讨论

对于难以分离和纯化的病原真菌来说，病原真菌的早期发现和准确检测对灵芝栽培业具有重要参考意义。传统的分离、检测方法由于限制因素过多且很难在病原菌早期侵染时作出及时、准确的鉴定，而分子生物学检测方法可以对病原真菌进行早期检查，及时控制病原菌的传播并且防止病害的流行。

本研究主要目的是建立由长枝木霉引发的灵芝木霉病的快速检测体系。研究结果表明，根據rDNA-RPB2基因序列的分析设计引物，0177-2-1和0177-2-2对所研究的目标菌株存在特异性，对其他近似种的菌株无特异性。凝胶成像系统中观察发现存在少量条带，但并不影响引物的特异性，在后续研究中可以进一步改进。所以该检测体系可用作对长枝木霉的特异性检测，能够用来区分其他物种。

目前针对于木霉所引起的灵芝绿霉病快速检测体系研究仅黄鑫伟等[9]对侧耳木霉进行过报道，而传统的检测方法主要是基于子实体的形态学特征并结合其生理生化性状的描述、平板分离病原菌、免疫学检测和鉴定的方法对病原真菌进行鉴别。存在着方法耗时长，经验性强，效率和检测灵敏度低、程序繁琐等缺点，并且不易从发病初期的植株中分离鉴定病原菌，难以做到对病害的早期发现和检测。而本研究所建立的体系从分子水平对样品进行分析和鉴定，結果准确性极高，并且具有高度特异性和灵敏性，为有效防治由长枝木霉所引发的灵芝木霉病提供了技术支持，同时也为相关研究提供了参考。

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