两种细菌降解新疆大南湖褐煤的最优工艺条件*

周 静 刘向荣，2 赵顺省，2 杨再文，2 代爱萍，2 卢 璇

(1.西安科技大学化学与化工学院，710054 西安；2.自然资源部煤炭资源勘察与综合利用重点实验室，710021 西安)

0 引 言

新疆煤炭储量占全国煤炭预测储量的40%，其中东疆地区褐煤资源最多，保有储量100亿t[1-2]。褐煤因水分高、挥发分高、热值低、易风化自燃等缺点而被视为劣质燃料[3]，目前主要用于发电、供热及热解转化成化工产品，转化效率低，污染大，严重制约了褐煤资源的安全高效开发和利用[4-5]。因此，寻找一条绿色环保的褐煤利用途径极为重要。而煤的微生物转化技术，主要利用细菌、真菌和放线菌等微生物作用实现煤的液化和气化，从而制取清洁燃料和高附加值化学品，转化过程设备简单、条件温和、能耗低，是新疆褐煤高效清洁利用的潜在途径[6-8]。

相比其他微生物，大部分细菌对煤的降解效果较好，降解产物易分离[9]。目前降解煤的细菌主要从矿井水中分离、从能降解木质素的细菌和能降解原油烃的细菌中选取[10-11]。ROMANOWSKA et al[12]曾成功从原油烃降解细菌中筛选出两株能够降解褐煤的菌株，降解效果良好。

因此，本实验选择两种降解原油的细菌冷湖游动微菌和格尔木马赛菌对新疆大南湖褐煤进行降解，探究了培养方式、煤样粒度、接种量、煤浆质量浓度和降解时间对细菌降解大南湖煤的影响，进一步通过正交实验确定最优工艺条件，最后利用红外光谱、热重和N2吸附对固相降解产物进行分析，利用气相色谱-质谱联用对液相降解产物进行分析，以此探讨褐煤的微生物降解过程和产物组成，并对细菌降解褐煤的机理进行推测，为利用微生物清洁转化褐煤提供基础信息。

1 实验部分

1.1 煤样及预处理

实验所用煤样为新疆大南湖褐煤，煤样经破碎、研磨，并筛分为<0.075 mm，0.075 mm～0.125 mm，0.125 mm～0.250 mm，0.25 mm～0.50 mm和0.50 mm～0.63 mm 5种粒径。利用8 mol/L的硝酸溶液浸泡上述煤样24 h后，用蒸馏水进行洗涤、过滤，直至中性，干燥，分装备用。

1.2 菌种

实验所用两种细菌为冷湖游动微菌(Planomicrobiumlenghuensis)和格尔木马赛菌(Massiliagolmudensis)，均购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，其编号分别为CICC 24462和CICC 24458。两种细菌严格按照供货方所提供的方法进行培养，经过4代培养，用于后续实验。

1.3 培养基

实验所用冷湖游动微菌和格尔木马赛菌的培养基为LB培养基(由供货商提供配方)，组成见表1。将配制的培养基用立式压力蒸汽灭菌锅(BL-50A)在105Pa的压力下灭菌15 min，备用。

表1 LB培养基的成分Table 1 Composition of LB culture media

1.4 菌种的培养

取斜面活化好的菌种，接种于300 mL液体培养基中，在温度为30 ℃、转速为160 r/min的恒温振荡培养箱中进行培养，选取对数生长期的扩大培养液用于褐煤的降解实验。

1.5 微生物降解实验

1.5.1 单因素实验

单因素实验设计见表2。将0.3 g粒度为0.075 mm～0.125 mm的煤样和50 mL液体培养基置于150 mL的锥形瓶中，放入灭菌锅，高压灭菌15 min，待培养基冷却到室温时，加入15 mL菌液，然后将锥形瓶放入温度为30 ℃、转速为160 r/min的恒温振荡培养箱(摇床培养)或温度为30 ℃的恒温生化培养箱(静置培养)中进行培养[13]，实验结束后，离心(10 000 r/min，20 min)，分离得到未降解的固相产物(剩煤)和液相产物。用蒸馏水对剩煤进行洗涤，直至剩煤中无菌体残留，烘干，备用。相同培养条件下，分别改变培养方式、煤样粒度、接种量、煤浆质量浓度和降解时间，研究各因素对微生物降解褐煤效果的影响。

表2 单因素实验设计Table 2 Design of single factor experiment

1.5.2 正交实验

在单因素实验的基础上，利用Minitab软件设计L16(44)正交设计表，对两种细菌降解褐煤的工艺条件进行正交设计。选取煤样粒度(A)、接种量(B)、煤浆质量浓度(C)和降解时间(D)4个因素，各因素又分为4个水平，不考虑各个因素之间的交互作用，培养方式为摇床培养。正交实验因素及水平见表3。

表3 两种细菌降解氧化煤的正交实验因素及水平Table 3 Orthogonal test factors and levels of oxidized coal biodegraded by two kinds of bacteria

1.6 降解率的测定和计算

褐煤降解实验结束后，离心(10 000 r/min，20 min)，收集固相产物(剩煤)和液相产物。液相产物经0.22 μm微孔滤膜过滤，稀释30倍，以蒸馏水为参比，测定450 nm处的吸光度(λ450)，λ450值越大，表明降解效果越好；同时用蒸馏水对剩煤进行洗涤，直至剩煤中无菌体残留，烘干称重，利用公式(1)计算降解率η[14]：

η=(m0-m)/m0×100%

(1)

式中：m0为起始加入煤的质量，g；m为降解实验结束后剩煤的质量，g。

1.7 降解产物的分析与表征

利用红外光谱、热重和N2吸附对原煤、氧化煤和固相产物(剩煤)进行分析与表征，利用气相色谱-质谱联用对液相产物进行分析与表征。

固相产物：将剩煤与溴化钾以1∶200(质量比)混合研磨至细粉，制成薄片，在4 000 cm-1～500 cm-1范围内，分辨率为4 cm-1，用美国Thermo Scientific傅立叶变换红外光谱仪进行扫描。采用SETARAM Labsys Evo型热重分析仪对剩煤进行热重分析，温度范围为30 ℃～800 ℃，保护气为氮气，升温速率为15 ℃/min。采用Micromeritics ASAP 2020型物理吸附分析仪对剩煤进行氮气吸附分析。原煤和氧化煤的分析方法与剩煤相同。

液相产物：将除菌过滤器过滤后的液相产物依次用二氯甲烷、甲苯、乙酸乙酯萃取，液相产物与有机溶剂的萃取体积比为1∶2，萃取液利用岛津GC-MS QP2010 Plus型气相色谱-质谱联用仪进行分析，流动相为甲醇，气氛为氦气。

2 结果与讨论

2.1 煤样的工业分析和元素分析

原煤、氧化煤及剩煤的工业分析和元素分析结果见表4。由表4可知，褐煤水分较高，碳含量偏低，属低变质程度煤。原煤经硝酸处理后，碳含量降低，氧和氮含量升高，这可能是因为硝酸氧化了褐煤，破坏了煤的分子结构，同时硝酸中的氮向煤中转移，造成氮含量升高[15]。氧化煤经细菌作用后，氧和氮含量升高，说明这两种细菌对氧化煤有一定的降解能力，能将氧化煤分子中的化学键断裂生成小分子物质，同时降解过程可能伴随着氧化作用[16]。

表4 煤样的工业分析和元素分析Table 4 Proximate and ultimate analyses of coal samples

2.2 单因素实验结果

2.2.1 培养方式对氧化煤降解效果的影响

摇床培养和静置培养两种培养方式对两种细菌降解氧化煤效果的影响如图1所示。由图1可知，培养方式对两种细菌降解氧化煤的影响显著，两种细菌摇床培养的降解效果均明显高于相对应的静置培养的降解效果。这可能是因为：第一，两种细菌都属于好氧菌，摇床培养使培养基形成涡流，延长气体在培养基中的停留时间，增加培养基的溶氧率，有利于细菌的生长繁殖；第二，静置培养使大部分煤样沉到锥形瓶底部，不能与菌株产生的活性物质充分接触，而摇床培养能够使氧化煤与菌株产生的活性物质充分接触，更有利于降解[17]。

图1 培养方式对氧化煤降解效果的影响Fig.1 Effects of culture modes on oxidized coal biodegradation

2.2.2 煤样粒度对氧化煤降解效果的影响

煤样粒度对两种细菌降解氧化煤效果的影响如图2所示。由图2可知，随着煤样粒度的减小，λ450值逐渐增大，但当煤样小于0.075 mm时，λ450值变小。这可能是因为煤样的粒度越小，比表面积越大，微生物释放的活性物质和煤样的接触概率就越高，降解效果也就越好；但当煤样粒度过小时，小粒径煤样容易团聚在一起，影响细菌与煤样的充分接触，从而影响降解效果[18]。

图2 煤样粒度对氧化煤降解效果的影响Fig.2 Effects of coal particle size on oxidized coal biodegradation

2.2.3 接种量对氧化煤降解效果的影响

接种量对两种细菌降解氧化煤的影响如图3所示。由图3可知，冷湖游动微菌降解液相产物的λ450值随着接种量的增大呈现出先增加后减小的趋势，接种量为20 mL/50 mL培养基时，λ450值最大，降解效果最好。这可能是因为接种量较低时，煤浆环境对细菌生长有抑制作用；随着接种量的增加，抑制作用减弱；当接种量超过一定数值后，有限的营养物质导致了细菌之间的竞争和抑制，从而影响降解效果[19]。接种量对两种细菌降解氧化煤的影响不同，格尔木马赛菌降解液相产物的λ450值随着菌液量的增加而不断地减小，接种量为1 mL/50 mL培养基时，λ450值最大，降解效果最好，这可能是因为不同细菌的生长繁殖能力不同[20]。

图3 接种量对氧化煤降解效果的影响Fig.3 Effects of inoculum amount on oxidized coal biodegradation

2.2.4 煤浆质量浓度对氧化煤降解效果的影响

煤浆质量浓度对两种细菌降解氧化煤的影响如图4所示。由图4可知，随着煤浆质量浓度增大，两种细菌降解液相产物的λ450值呈现先增大后减小的趋势，两种细菌降解氧化煤的最优煤浆质量浓度都是0.5 g/50 mL培养基。这可能是因为煤浆质量浓度较低时氧化煤中可被利用的碳源有限，过少的碳源不能提供充足的能源物质；煤浆质量浓度过大时，导致细胞损伤，抑制菌株生长[21]。

图4 煤浆质量浓度对氧化煤降解效果的影响Fig.4 Effects of coal slurry mass concentration on oxidized coal biodegradation

2.2.5 降解时间对氧化煤降解效果的影响

降解时间对两种细菌降解氧化煤的影响如图5所示。由图5可知，两种细菌在接种后就开始快速降解氧化煤，吸光度λ450值随降解时间的增加而快速增大，第12天后A450值随降解时间变化不大。可能是因为当降解时间在12 d以后，培养基中的营养成分几乎被细菌消耗殆尽，活菌数量减少[22]，说明两种细菌对氧化煤的最优降解时间是12 d。同时观察到两种细菌在相同时间内的降解效果不同，这可能是因为不同细菌对环境的适应能力不同，分泌活性物质的量和时间也不相同[23]。

图5 降解时间对氧化煤降解效果的影响Fig.5 Effects of degradation time on oxidized coal biodegradation

2.3 正交实验结果

两种细菌降解氧化煤的正交实验结果如表5所示，实验的均值响应如表6所示。由表6可知，在选定的实验条件区间，各因素对两种细菌降解氧化煤影响的主次顺序依次为A，C，D，B，即煤样粒度、煤浆质量浓度、降解时间、接种量。从方差分析(见表7)中也可以看出，煤样粒度在两种细菌对氧化煤降解过程中产生了显著性影响。冷湖游动微菌降解氧化煤的主效应见图6。由图6可知，冷湖游动微菌降解氧化煤的最优工艺参数组合为A2B1C2D3，即煤样粒度0.075 mm～0.125 mm、接种量15 mL/50 mL培养基、煤浆质量浓度0.5 g/50 mL培养基、降解时间14 d，此条件下最大降解率为51%。

图6 冷湖游动微菌降解氧化煤的主效应Fig.6 Main effects of oxidized coal biodegraded by P.lenghuensis

表5 两种细菌降解氧化煤的正交实验结果Table 5 Orthogonal test results of oxidized coal biodegraded by two kinds of bacteria

表6 两种细菌降解氧化煤的均值响应Table 6 Mean response of oxidized coal biodegraded by two kinds of baceria

表7 两种细菌降解氧化煤的方差分析Table 7 Variance analysis of oxidized coal biodegraded by two kinds of bacteria

格尔木马赛菌降解氧化煤的主效应见图7。由图7可知，格尔木马赛菌降解氧化煤的最优工艺参数组合为A2B2C1D4，即煤样粒度0.075 mm～0.125 mm、接种量2 mL/50 mL培养基、煤浆质量浓度0.4 g/50 mL、降解时间16 d，此条件下最大降解率为59%。

图7 格尔木马赛菌降解氧化煤的主效应Fig.7 Main effects of oxidized coal biodegraded by M.golmudensis

2.4 红外光谱分析

图8 原煤和氧化煤及剩煤的红外光谱Fig.8 FTIR spectra of raw coal, oxidized coal and residual coals

2.5 热重分析

原煤、氧化煤及两种细菌降解后剩煤的TG-DTG曲线如图9所示，热失重特征参数如表8所示。由图9和表8可以看出，各煤样具有相同的热失重趋势，大致可分为3个热失重阶段：干燥脱气阶段、活泼分解阶段和二次脱气阶段。

表8 煤样热失重特征参数Table 8 Pyrolysis characteristic parameters of coal samples

与原煤相比，其他煤样经硝酸氧化后，第一阶段热失重率低于原煤热失重率，第三阶段热失重率高于原煤热失重率，总失重率高于原煤总失重率。这可能是因为第一阶段温度较低，煤热解主要是吸附水和吸附气体的脱除，硝酸处理降低了煤的含水量；第三阶段煤热解温度较高，在第二阶段反应的基础上发生半焦的二次热解，挥发分大量析出，硝酸处理增大了煤的平均孔径，有利于挥发分的释放[26]。氧化煤三个热失重阶段的最大热失重速率对应的温度tP1，tP2，tP3皆降低，说明经硝酸氧化后的煤样反应活化能降低，受热更容易分解，热稳定性降低[27]。

较氧化煤而言，煤样经细菌降解后，第一阶段的温度区间明显延长，第二和第三阶段向高温方向移动，三个热失重阶段的最大失重速率所对应的温度皆升高，冷湖游动微菌降解后的剩煤总失重率与氧化煤相近，格尔木马赛菌降解后的剩煤总失重率高于氧化煤，两种细菌降解后的剩煤最大失重速率所对应的温度tP1，tP2，tP3均升高，说明氧化煤分子结构中脂肪族侧链或芳香族侧链等较弱的部分被细菌降解了，煤样的稳定性得到提高。

2.6 N2吸附分析

原煤、氧化煤和两种细菌降解后剩煤的N2吸附-脱附等温线见图10。由图10可知，四条曲线较为相似，曲线的前半段在相对压力小于0.9时几乎不上升，而曲线的后半段在相对压力大于0.9时急剧上升且相对幅度较大，吸附线和脱附线重合度很高，没有出现滞后环，表明4种煤样的吸附-脱附曲线均属于BET分类方案中Ⅰ型曲线[28]，煤内孔隙结构多为一端封闭的尖劈形和圆筒形的小孔和微孔[29]。在相同压力下，N2吸附体积由大到小的煤样依次为原煤、格尔木马赛菌降解后剩煤、氧化煤、冷湖游动微菌降解后剩煤，原煤经硝酸氧化后N2吸附体积急剧下降，说明硝酸改性使煤样中孔径处于中孔范围内的开放性孔结构大量坍塌，使煤样中吸附孔数量大量减少，不同微生物对煤孔隙结构的影响不同[30]。

图10 各煤样的N2吸附-脱附等温线Fig.10 Adsorption/desorption isotherms of N2 for coal samples

原煤、氧化煤和两种细菌降解后剩煤的累积比表面积、累积孔容与孔径分布关系如图11所示。由图11可知，随着孔径变小，4种煤样的累积比表面积和累积孔容增大，处理煤样的累积比表面积及累积孔容较原煤的差值也逐渐增大，其中硝酸氧化使煤样累积比表面积和累积孔容变化最大[31]。

图11 原煤和氧化煤及剩煤的累积比表面积、累积孔容与孔径分布关系Fig.11 Retalionship between cumulative pore area, cumulative pore volume and pore width distribution of raw coal, oxidized coal and residual coals

原煤、氧化煤和两种细菌降解后剩煤的孔结构分析见表9。由表9可以看出，硝酸预处理导致煤样的比表面积、微孔比表面积、累积孔容、微孔容显著降低，氧化煤经微生物作用后，煤样的比表面积、微孔比表面积、微孔容显著升高，硝酸氧化和微生物降解均使煤样平均孔径增大。这与上述孔径分析结果一致，表明硝酸预处理和微生物作用可以破坏煤的孔隙结构，导致煤样孔隙结构的坍塌[32]。

表9 煤样孔隙结构参数Table 9 Pore structure parameters of coal samples

2.7 气相色谱-质谱联用分析

两种细菌降解氧化煤液相产物总离子流色谱如图12和图13所示，液相产物中化合物的组成如表10所示。由图12和表10可知，用三种有机溶剂分别萃取冷湖游动微菌降解液相产物，在二氯甲烷萃取产物中检测到24种化合物，主要为烷烃类物质，相对分子质量在70～302之间；甲苯萃取产物检测到22种化合物，主要为烷烃类和芳香烃类物质，相对分子质量在106～282之间；乙酸乙酯萃取产物检测到37种化合物，主要为酯类和烷烃类物质，相对分子质量在40～399之间。由图13和表10可知，用三种有机溶剂分别萃取格尔木马赛菌降解液相产物，二氯甲烷萃取产物中检测到29种化合物，主要为烷烃类物质，相对分子质量在40～408之间；甲苯萃取产物中检测到18种化合物，主要为烷烃类和芳香烃类物质，相对分子质量在106～320之间；乙酸乙酯萃取产物中检测到32种化合物，主要为酯类、烷烃类和芳香烃类物质，相对分子质量在40～306之间。因此，两种细菌降解液相产物中的化合物组成相似，含量上有所差异，降解液相产物中主要含有烷烃类、芳香烃类、酯类等小分子物质，同时含有少量醛酮类、醇类、醚类、酚类、羧酸类和胺类等小分子物质，相对分子质量在40～408之间。

图12 冷湖游动微菌降解氧化煤液相产物的总离子流色谱Fig.12 Total ion chromatograms of liquid products of oxidized coal biodegradation by P.lenghuensis

表10 两种细菌降解氧化煤的液相产物中化合物的组成Table 10 Compositions of compounds in the liquid products of oxidized coal biodegraded by two kinds of bacteria

图13 格尔木马赛菌降解氧化煤液相产物的总离子流色谱Fig.13 Total ion chromatograms of liquid products of oxidized coal biodegradation by M.golmudensis

2.8 微生物降解褐煤的机理分析

图14 格尔木马赛菌降解新疆大南湖褐煤的机理Fig.14 Schematic mechanism of Xinjiang Dananhu lignite biodegraded by M.golmudensis

3 结 论

1) 通过单因素和正交实验，获得了两种细菌降解新疆大南湖褐煤的最优工艺条件。冷湖游动微菌降解的最优工艺条件：摇床培养，煤样粒度为0.075 mm～0.125 mm，接种量为15 mL/50 mL培养基，煤浆质量浓度为0.5 g/50 mL培养基，降解时间为14 d，此条件下降解率最高为51%。格尔木马赛菌降解的最优工艺条件：摇床培养，煤样粒度为0.075 mm～0.125 mm，接种量为2 mL/50 mL培养基，煤浆质量浓度为0.4 g/50 mL培养基，降解时间为16 d，此条件下降解率最高为59%。

2) 在达到相似降解率的条件下，格尔木马赛菌接种量较小，煤浆质量浓度较低，是降解新疆大南湖褐煤的优势菌。

3) 各因素对两种细菌降解效果的影响由大到小顺序均为：煤样粒度、煤浆质量浓度、降解时间、接种量，煤样粒度影响最为显著。

5) 两种细菌降解新疆大南湖褐煤的液相产物中的化合物组成相似，主要含有烷烃类、芳香烃类、酯类等小分子物质，相对分子质量在40～408之间。

6) 本研究基于优势菌格尔木马赛菌降解褐煤的固液相产物分析，推测出格尔木马赛菌降解新疆大南湖褐煤是多种机理共同作用的结果。