药品中金黄色葡萄球菌的定性检测和质量控制

韩珍珍，文玉辉

(运城市综合检验检测中心，山西 运城 044000)

金黄色葡萄球菌隶属葡萄球菌属，是革兰阳性菌的代表，广泛存在于动物和人体内，是人类化脓性感染最常见的病原菌，对各种理化因素都有较高的抵抗力[1]，是药品质量控制的重要指标之一[2]。为提高药品中金黄色葡萄球菌的检测能力，2020年本实验室参加由中国食品药品检定研究院组织的药品中金黄色葡萄球菌检测能力的验证，取得满意结果。通过本次能力验证，再次确认了实验室分析检测技术，为其他实验室提供了参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

NIFDDC-PT-288金黄色葡萄球菌检验能力验证样品3份，每份样品采用棕色西林瓶包装，铝盖密封，每瓶量按10 g计，编号为121(代号1)、176(代号2)、372(代号3)，由上海市食品药品检验所提供(中国食品药品检定研究院组织、上海市食品药品检验所负责实施)。

1.2 试剂及仪器

1.2.1 菌株及试剂

金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大肠埃希菌[CMCC(B)44102]均购于中国医学微生物菌种保存中心，使用前经全自动生化检定仪进行生化确认。甘露醇氯化钠琼脂培养基(北京三药，批号：200828)，冻干兔血浆(陆桥，批号：200917)，革兰氏染色液(陆桥，批号：200831)，阳性菌鉴定卡(GP)(法国生物梅里埃公司)等。

1.2.2 仪器

浊度仪(法国生物梅里埃公司)、VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定及药敏分析系统(法国生物梅里埃公司)、BHC-1300Ⅱ生物安全柜(苏净集团)、生化培养箱(上海博迅)、OLYMPUS显微镜等。

1.3 实验方法

能力验证作业指导书要求收到样品应尽快检测，未检测前放置在-20 ℃保存，并尽快检测。检测方法参照《中国药典》2015版四部通则1106非无菌产品微生物限度检查和控制菌检查方法。

1.3.1 菌种及培养基质控

金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌使用前经全自动生化检定仪进行生化确认。根据2015版药典对甘露醇氯化钠琼脂培养基进行培养基适用性检查，此培养基的促生长能力+指示特性(实验菌株：金黄色葡萄球菌)及抑制能力实验(实验菌株：大肠埃希菌)均符合要求。

1.3.2 前处理及划线接种

在生物安全柜内打开装有样品的西林瓶，向瓶内加入5 mL灭菌水，将样品完全溶解并混匀后，转移至90 mL胰酪大豆胨液体培养基中，再用灭菌水润洗西林瓶，总润洗体积为5 mL，将上述全部润洗液转移至胰酪大豆胨液体培养基中。以此方法分别处理3份样品，注意防止交叉污染(紫外灯杀菌30 min后操作下一个样品)，同时做阳性对照(加入金黄色葡萄球菌)和阴性对照(加入大肠埃希菌)，以上6瓶分别混匀后33 ℃培养18 h，将上述培养物分别划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，33 ℃培养48 h。

1.3.3 菌种鉴定

分别挑取甘露醇氯化钠琼脂平板上的可疑菌落A和B(来源1)、C和D(来源2)、E(来源3)共五种，进行触酶实验、革兰氏染色和血浆凝固酶试验，然后再进行VITEK2 Compact生化鉴定。

2 结果与分析

挑取甘露醇氯化钠琼脂平板上的疑似菌落，结合菌落形态特征(见图1)、触酶实验、革兰染色(见图2)、血浆凝固酶(见图3和图4)及VITEK2 compact生化鉴定结果，与阳性对照菌进行比对，确定1和3都未检出金黄色葡萄球菌，2检出金黄色葡萄球菌，详见表1。甘露醇氯化钠琼脂平板主要原理是金黄色葡萄球菌能在高盐平板上生长，发酵甘露醇产酸，菌落发黄且光滑湿润、边缘整齐无皱褶，所以排除菌落B和菌落C。触酶试验鉴定菌株是否产生过氧化氢酶。血浆凝固酶试验鉴定特点是血浆凝固，呈胨状倾斜不流动，据此排除A和E。

3 讨 论

本次中检院组织的药品中金黄色葡萄球菌检验能力验证结果为满意，我们主要做了以下准备：第一，在能力验证前对购买菌种及培养基进行质控且设置阳性和阴性对照，方便出现问题时查找原因[3]，再者进行预实验对所涉及到的标准菌株、试剂及培养基、仪器设备进行确认，统筹安排好人员、试验方法及步骤，考虑试验进行过程中可能出现的意外状况并做好相关的实验室预案，可以保证结果准确可靠。第二，实验操作过程对检验结果影响很大，操作过程的交叉污染和典型菌落的识别也易导致检验人员对结果的判断产生偏差[4]。本次能力验证样品数量为3组，分组操作，每次操作间均紫外杀菌30 min以上，避免样品的混淆和交叉污染，同时在使用标准菌株做质控时，先操作阴性对照，再处理待测样品，最后操作标准菌株。此外可疑菌落的确定是关键，要参照阳性菌株培养基上的形态、颜色、质地确定可疑菌落后再挑取。第三，血浆凝固酶实验应使用新鲜的培养物。放置时间过长的培养物血浆凝固酶活性会降低，一些菌株可产生使血浆凝集物解集的葡激酶和纤溶酶，会使已经凝固的血浆重新溶解，如不及时观察会产生假阴性结果[5]。此次试验脑心浸出液肉汤(BHI)为新鲜配制，接菌培养时间为18 h，血浆凝固酶实验每隔30 min观察1次，血浆凝固酶阳性菌株均在1 h后全部凝固，保证了时效。盛成兰等[6]指出部分金黄色葡萄球菌凝固酶产生量低，短时间内不易肉眼观察，易造成实验失败，故此试验在血浆凝固酶阳性的基础上又用全自动生化仪对结果进一步确认。第四，实验结束后，整理数据也是至关重要的环节，质控人员要核对样品编号，从小到大有序排列，避免样品编号混淆。

图1 甘露醇氯化钠琼脂平板(金黄色葡萄球菌)

图2 放大1000×的金黄色葡萄球菌

图3 血浆凝固酶试验

图4 血浆凝固酶试验(凝固不流动)

表1 样品在甘露醇氯化钠琼脂培养基上的菌落特征及生化鉴定结果表