实时荧光跨越式滚环等温扩增技术检测食品中的志贺氏菌

王立娟，郭威，张先舟，马晓燕，张伟，2，3*

（1.河北农业大学食品科技学院，河北 保定 071001；2.河北农业大学生命科学学院，河北 保定 071001；3.河北农业大学理工学院，河北 沧州 061100）

食源性疾病是全世界关心的重要公共卫生问题，志贺氏菌病占其中很大一部分[1]，它是由志贺氏菌引发的一种急性肠胃疾病[2]，临床特征包括发烧、腹部疼痛、中度到重度水样腹泻[3]。一旦治疗不及时，可能会导致肠道炎、脱水甚至死亡，严重危害身体健康，特别是儿童和免疫缺陷人群[4]。志贺氏菌主要存在于手工加工的蔬菜沙拉、鲜奶制品或煮熟后的肉制食品中[5]，常引起食物中毒。因此，志贺氏菌的检测在食品安全领域具有重要意义[6]，建立一种新的快速、灵敏、特异性高的检测方法，对于及时检出食品中的志贺氏菌至关重要。

志贺氏菌的检测方法大致分为三大类，即传统培养方法、免疫学方法和分子生物学方法[7]。传统培养方法以GB 4789.5—2012《食品安全国家标准食品微生物检验志贺氏菌检验》方法为主[8]，该方法是鉴定志贺氏菌的现行标准，检测准确度高且稳定。但是传统方法检测志贺氏菌操作繁琐，耗时费力且每次处理的样品数量很少，不能满足快速检测的需求。免疫学方法以酶联免疫吸附技术（enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA）[9]、胶体金免疫层析技术（immune colloidal gold technique，GICT）[10]较为常见。免疫学方法虽然大大缩短了检测时长[11]，但灵敏度较低[12]。分子检测技术主要包括聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）[13]、环介导等温扩增方法（loop mediated isothermal amplification，LAMP）[14]、滚环扩增技术（rolling circle amplification，RCA）[15]等。PCR 和实时荧光定量PCR检测技术与传统方法和免疫学方法相比，虽然有许多优点，但是其相对于等温扩增技术LAMP、RCA等扩增效率和灵敏度较低。LAMP和RCA技术可高效扩增DNA，但是LAMP需要4条～6条引物，这些引物的设计和反应体系复杂，引物之间易相互作用，产生非特异性结果，且无法通过对扩增产物测序，判断扩增结果的正确性。RCA技术扩增线性DNA则需要锁式探针和连接酶[16]，且需要探针环化，操作过程复杂，耗时长约4 h。

近年来，跨越式滚环等温扩增（saltatoryrollingcircle amplification，SRCA）技术被用于多种病原菌检测[17-20]，该方法克服了等温扩增技术的缺点，仅需要2条引物，在Bst DNA聚合酶的作用下，不需人为环化，即可实现线性DNA的扩增[21]。本研究以期在SRCA方法的基础上，根据志贺氏菌特异性基因ipaH设计筛选引物，建立一种高效、灵敏的实时荧光跨越式滚环等温扩增（real-time fluorescence saltatory rolling circle amplification，RF-SRCA）方法对志贺氏菌进行检测，以有效检出病原菌，保障食品安全和消费者健康。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌株

本研究采用32株菌进行RF-SRCA方法特异性检测，其中志贺氏菌13株，非志贺氏菌19株。菌株名称及其来源如表1所示。

表1 试验菌株Table 1 The strains list in this study

续表1 试验菌株Continue table 1 The strains list in this study

1.1.2 样品与试剂

试验所用60种食品样品：当地各超市和农贸市场随机购买。

细菌DNA提取试剂盒：天根生化科技有限公司（北京）；RF-SRCA引物：北京华大基因有限公司；Eva－Green染料：安诺伦生物科技公司（北京）；Bst DNA聚合酶（large fragment）（8 000 U/mL）：美国 NEB 有限公司；Luria-Bertani液体培养基、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐（xylose lysine desoxycholate agar，XLD）琼脂：陆桥技术股份有限公司（北京）。

1.1.3 主要仪器设备

Archimed实时荧光定量PCR仪：鲲鹏基因科技公司（北京）；Nanodrop 2000蛋白质核酸分析仪：美国Thermo Scientific公司；BINDA2020D凝胶成像仪：北京宾达英创有限公司；DYY-8C型电泳仪：北京市六一仪器厂；DK-8D三孔电热恒温水槽：上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 引物的设计

在NCBI中选取同源性最高的志贺氏菌特异性基因ipaH的基因序列，利用Primer premier 6.0和DNAMAN进行引物的筛选与设计。引物由北京华大基因有限公司合成，引物信息如表2所示。

表2 RF-SRCA和SRCA方法的引物Table 2 Primers of RF-SRCA and SRCA methods

1.2.2 菌株培养和DNA提取

将志贺氏菌菌株（ATCC12022）划线于XLD琼脂培养基中，37℃培养20 h～48 h，挑取单菌落接种于Luria-Bertani液体培养基中培养12 h，取1 mL菌液使用提取细菌DNA试剂盒进行DNA提取。使用Nanodrop 2000蛋白质核酸分析仪测定提取的DNA纯度和浓度。表1中其它菌株同上操作，提取的DNA于-20℃保存备用。另取1 mL志贺氏菌菌液用9 mL无菌生理盐水10倍梯度稀释，选取可计数范围内的3个稀释度菌液，每个稀释度3个平行，用平板计数的方法进行初始菌落计数。

1.2.3 反应体系与反应条件

RF-SRCA 的反应体系：dNTPs（2.5 mmol/L）添加量为 4.5 μL，Bst DNA 聚合酶添加量为 1.0 μL，Bst DNA聚合酶反应缓冲液添加量为2.5 μL，20×EvaGreen染料添加量为1.0μL，MgSO4（20mmol/L）添加量为2.0μL，正反向引物（10 μmol/L）添加量各为 1.0 μL，模板 DNA添加量为1.0 μL，无菌双蒸水补足体积到20 μL。阴性对照用无菌双蒸水代替模板DNA。

RF-SRCA的反应条件：首先将模板DNA在PCR仪中94℃预变性3 min，4℃冷却2 min。预变性后的模板与 dNTPs、MgSO4、10 × Thermo Pol Reaction Buffer、引物、Bst DNA聚合酶和无菌双蒸水添加到200 μL离心管中，并于避光环境下加入1 μL EvaGreen（20×）染料，最后放入实时荧光定量PCR仪中。实时荧光定量PCR仪程序为64℃进行15 s，64℃进行1 min，每次循环结束采集一次信号，循环40次。结果以扩增曲线为“S”型且循环阈值（cycle threshold，Ct值）在 5～30之间为阳性，否则为阴性。对扩增后的产物进行64℃～96℃的熔解曲线分析，熔解曲线为单峰且熔解温度（melt temperature，Tm值）在80℃～90℃之间说明引物特异性较好，扩增产物单一。

SRCA反应体系如上述RF-SRCA反应体系，反应过程使用水浴锅64℃加热60 min；82℃灭酶活2 min以终止反应。将SRCA反应扩增产物用浓度为2.0%的琼脂糖凝胶进行电泳验证，凝胶电泳图出现清晰的梯形条带为阳性，否则为阴性。

1.2.4 RF-SRCA方法特异性试验

本研究使用32株菌株对RF-SRCA方法进行特异性验证，其中包括13株志贺氏菌和19株非志贺氏菌。实时荧光曲线法确定RF-SRCA的特异性。

1.2.5 RF-SRCA方法灵敏度试验

经测定，1.2.2中提取的志贺氏菌DNA纯度A260/A280为1.858，浓度为5.97×107fg/μL。将其使用无菌DNA稀释液进行10倍梯度稀释至5.97×10-1fg/μL。分别使用RF-SRCA和SRCA方法进行检测，根据实时荧光曲线法测定RF-SRCA方法灵敏度，凝胶电泳图测定普通SRCA灵敏度，将RF-SRCA的灵敏度同SRCA方法进行比较。

1.2.6 RF-SRCA方法检出限试验

取1 mL 1.2.2中过夜培养的志贺氏菌菌液（8.6×109CFU/mL）加入到9 mL灭菌后的牛奶中，混匀后从中取1 mL加入9 mL无菌牛奶中连续10倍梯度稀释至8.6×10-1CFU/mL。使用试剂盒提取DNA，各取1 μL作为反应模板，分别进行RF-SRCA和SRCA试验，将RF-SRCA的检出限同SRCA方法进行比较。

1.2.7 RF-SRCA方法对实际样品的检测与评估

为了评估RF-SRCA方法检测志贺氏菌的适用性，在当地各超市和农贸市场采集60份食品样品，包括25份蔬菜和蔬菜沙拉、20份牛奶、15份肉制品。将样品均质后于37℃培养8 h，取1 mL的均质液使用试剂盒提取DNA。以提取的DNA为模板，以GB/T 47895—2012《食品安全国家标准食品微生物学检验志贺氏菌检验》为参考，用SRCA方法和RF-SRCA方法进行实际样品检测。并用敏感性、特异性和符合率对RF-SRCA方法评估，计算公式参考文献[22]。

2 结果与分析

2.1 RF-SRCA方法特异性分析

RF-SRCA方法引物的设计筛选决定检测方法的特异性。本研究选择32株菌株进行RF-SRCA反应，包括13株志贺氏菌和19株沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、李斯特杆菌等非志贺氏菌。RF-SRCA方法的特异性结果见图1。

图1 RF-SRCA方法的特异性结果Fig.1 Specificity results of RF-SRCA method

如图1A所示1～13号志贺氏菌Ct值在13左右且曲线为“S”型，故确定为阳性结果，而14～32号非志贺氏菌没有扩增为阴性结果。图1B所示1～13号志贺氏菌的熔解曲线呈单峰Tm值在85℃左右，14～32号非志贺氏菌无单峰出现，证明该方法的特异性良好。

2.2 RF-SRCA方法灵敏度分析

按照1.2.3方法进行RF-SRCA和SRCA反应，灵敏度扩增结果见图2。

图2 RF-SRCA和SRCA灵敏度扩增结果Fig.2 RF-SRCA and SRCA sensitivity amplification results

RF-SRCA扩增曲线如图2A，DNA浓度为5.97×106fg/μL～5.97 × 100fg/μL（曲线 1～7）扩增曲线呈“S”型为阳性结果；DNA浓度为5.97×10-1fg/μL（曲线8）时为阴性结果。故RF-SRCA扩增曲线方法检测志贺氏菌的灵敏度为5.97×100fg/μL。普通SRCA扩增产物通过凝胶电泳进行判断，由图2B可知凝胶电泳条带随着模板浓度变低条带亮度变暗，在DNA浓度小于5.97×101fg/μL（图 2B 序号 7、8）时没有条带产生，故可知SRCA凝胶电泳的灵敏度为5.97×101fg/μL。由此可知，RF-SRCA的灵敏度比普通SRCA反应灵敏度高10倍。

2.3 RF-SRCA方法检出限分析

RF-SRCA方法检测人工污染志贺氏菌的牛奶检出限，由平板计数法测得志贺氏菌纯培养物的活菌数为8.6×109CFU/mL，进行10倍梯度稀释至8.6×10-1CFU/mL。RF-SRCA和SRCA检出限扩增结果见图3。

图3 RF-SRCA和SRCA检出限扩增结果Fig.3 RF-SRCA and SRCA detection limit amplification results

如图3A所示，牛奶中志贺氏菌浓度小于8.6×100CFU/mL时（曲线8）为阴性结果，故RF-SRCA检测牛奶中的志贺氏菌的检出限为8.6×100CFU/mL。SRCA方法检出限结果如图3B，当人工污染牛奶中的志贺氏菌浓度小于8.6×101CFU/mL（序号7、8）时，没有出现梯形条带，故判定为阴性。因此，普通SRCA凝胶电泳检测人工污染的牛奶检出限为8.6×101CFU/mL。经过比较RF-SRCA检出限比普通SRCA低10倍。

2.4 实际样品检出率分析

RF-SRCA、SRCA和国标法检测60份实际样品结果如表3所示。

表3 3种方法60份实际样品检出率比较Table 3 Comparison of detection rates of 60 samples of three methods

RF-SRCA和传统SRCA方法阳性样品检出率和检出样品一致。RF-SRCA一般反应0.17 h～0.50 h即可出现扩增结果，而传统SRCA反应1 h后进行凝胶电泳确定扩增结果，需要2.0 h左右，RF-SRCA比SRCA的检出时间更短。RF-SRCA和SRCA方法检测60份食品样品中的志贺氏菌结果相同，检出的阳性样品是蔬菜沙拉，而经过高温灭菌的熟食和牛奶中没有检出。

以GB/T 4789.5—2012《食品安全国家标准食品微生物学检验志贺氏菌检验》为参考，RF-SRCA比其多一份阳性，没有假阴性，可得阳性检出率为3.33%，敏感性为100%，特异性为98.31%，符合率为98.33%。可能是该方法灵敏度较高或样品中存在活的但不可培养（viable but non-culturable，VBNC）状态的志贺氏菌。综上，RF-SRCA方法满足实际样品检测的需要，灵敏度高且检测时间较短。

3 结论与讨论

本研究针对志贺氏菌特异性基因ipaH设计了一对引物，进行RF-SRCA扩增反应。对RF-SRCA法进行特异性检测：志贺氏菌为阳性检测结果，其它非志贺氏菌为阴性结果，证明该方法特异性良好。RF-SRCA的灵敏度为 5.97×100fg/μL，检出限为 8.6×100CFU/g，灵敏度比普通SRCA方法高10倍，检出限比普通SRCA低10倍。RF-SRCA方法检测实际样品比国家标准方法检出率高1.66%，进一步说明该方法灵敏度较高。

根据文献报道qPCR方法和实时荧光LAMP（realtime fluorescence LAMP，RF-LAMP） 检测志贺氏菌，检出限均为102CFU/mL数量级[23-24]。RF-SRCA与其相比，检出限在数量级上低100倍。与实时荧光重组酶聚合酶扩增技术（real-time fluorescence recombinase polymerase amplification，RF-RPA）[25]相比，RF-SRCA 只需要Bst DNA聚合酶参与反应，而RF-RPA需要重组酶和聚合酶完成扩增反应，检测成本较高。因此，RFSRCA检测方法灵敏度高、简便经济、准确高效。

综上，本研究建立检测志贺氏菌的RF-SRCA方法是一种操作简单、高特异性、高灵敏度、低检出限的快速检测方法，在致病菌检测方面具有很广阔的应用前景，为致病菌检测提供了新的思路，在食品检验领域具有较高的应用价值。