不同炮制方法对吴茱萸生物碱类有效成分含量的影响*

陈 路，冯世鑫，蒋 妮，宋利沙，白隆华，陈乾平

（广西壮族自治区药用植物园，广西 南宁530023）

吴茱萸为芸香科植物吴茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.的干燥近成熟果实，主产于广西、贵州、云南等地，具有散寒止痛、降逆止呕等功效[1]。其含有多种化学成分，目前从中分离的主要有生物碱、柠檬苦素类、挥发油等成分，生物碱类成分是吴茱萸主要有效成分之一，其中吴茱萸碱和吴茱萸次碱含量较高，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、镇痛等多种药理活性[2－7]。吴茱萸在临床应用中多用生品和炮制品，但不同炮制方法对吴茱萸生物碱的含量影响较大。中药的炮制可改变其性味归经和有效成分，进而影响药理作用和临床应用效果[8]。本研究中对吴茱萸生品及黄连水炒吴茱萸、热水浸吴茱萸、黄连制吴茱萸3种炮制品中的生物碱含量进行分析，为该药材的临床应用提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Varian 210型高效液相色谱仪（美国Varian公司）；SB－5200D型超声波清洗仪（宁波新芝生物科技股份有限公司，功率为200 W，频率为40 kHz）；BSA124S型电子分析天平（德国Sartoriu公司，精度为万分之一）；UV－1240型紫外－可见光光度计（日本Shimadzu公司）。

1.2 试药

吴茱萸碱对照品（批号为110802－201710，含量为99.6%），吴茱萸次碱对照品（批号为110801－201608，含量为99.7%），去氢吴茱萸碱对照品（批号为20531－201703，含量为98%），均购自中国食品药品检定研究院；吴茱萸卡品碱对照品（成都克洛玛生物科技有限公司，批号为CHB170224）；吴茱萸药材采自广西马山县周鹿镇吴茱萸种植基地，经广西药用植物园彭玉德高级工程师鉴定为正品，批号分别为202006，202007，202008，分别编号为A1，A2，A3；黄连（南宁生源中药饮片有限公司，批号为20191206）；乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC－C18柱（100 mm×4.6 mm，2.7 μm）；检测波长：330 nm；流速：0.8 mL／min；进样量：10 μL；柱温：30℃；流动相：乙腈（A）－0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脱（0～3 min时5%A，3～10 min时5%A→10%A，10～15 min时10%A→15%A，15～23 min时15%A→25%A，23～26 min时25%A→50%A，26～30 min时50%A→80%A，30～35 min时80%A→100%A）[9]。此色谱条件下的色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图1.evodiamine 2.rutaecarpine 3.dehydroarutaecarpine 4.evocarpine A.Mixed reference solution B.Raw Euodiae Fructus solution C.Stir－fried Euodiae Fructus with water decoction of Coptidis Rhizoma solution D.Soaking Euodiae Fructus in hot water solution E.Fried Euodiae Fructus with Coptidis Rhizoma solutionFig.1 HPLC chromatograms

2.2 吴茱萸炮制品制备

黄连水炒吴茱萸[10]：取黄连饮片10 g，加5倍量水，煎煮3次，过滤，合并水煎液，浓缩至20 mL；另取净吴茱萸（A1）100 g，加2倍量沸水，浸润2 h，取出，晒干，置铜锅内，加黄连水于150℃喷炒8 min，即得。

黄连制吴茱萸[11－12]：取黄连饮片5 g，加5倍量水，煎煮3次，过滤，合并水煎液，浓缩至120 mL；另取净吴茱萸（A1）100 g，将黄连汁趁热倒入，焖润2 h，炒至微干，取出，晾晒至干，即得。

热水浸吴茱萸：取净吴茱萸（A1）100 g，加2倍量沸水，浸润2 h，取出，晾晒至干，即得。

2.3 溶液制备

供试品溶液[13－14]：取吴茱萸生品及其不同炮制品适量，粉碎后过3号筛，取0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，称定质量，浸泡1 h，超声处理40 min，冷却后再称定质量，用70%乙醇补足减失的质量，摇匀，微孔滤膜滤过，即得。

混合对照品溶液：取吴茱萸碱、吴茱萸次碱、去氢吴茱萸碱和吴茱萸卡品碱对照品各适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度分别为1.0482，1.3526，0.2042，0.5061mg／mL的对照品贮备液。取上述对照品贮备液各适量，加甲醇制成一定质量浓度的混合对照品溶液。

2.4 方法学考察

线性关系考察：分别精密吸取2.2项下各对照品贮备液1.0，2.0，5.0，10.0，15.0，20.0 μL，注入色谱仪，按2.1项下色谱条件分别进样测定，记录色谱图。以各成分峰面积（Y）为纵坐标、含量（X，μg）为横坐标进行线性回归，得回归方程(见表1)。结果表明，各成分含量均在各自范围内与峰面积线性关系良好。

表1 吴茱萸中4种生物碱线性关系考察与精密度、稳定性和重复性试验结果(n＝6)Tab.1 Results of linear relation，precision，stability and repeatability tests of four alkaloids in Euodiae Fructus（n＝6）

精密度试验：取2.3项下混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件，同一时间内重复进样6次，考察日内精密度；连续3 d重复进样6次，考察日间精密度。结果4种成分峰面积日内精密度的RSD介于0.65%～0.81%（n＝6），日 间 精 密 度 的RSD介 于1.16%～1.75%（n＝6），表明仪器精密度良好。详见表1。

稳定性试验：取同一批（编号为A1）样品，依法制备供试品溶液，分别于制备后0，2，4，8，12，24 h时按2.1项下色谱条件进样分析。结果各成分峰面积的RSD介于0.82%～1.36%（n＝6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。详见表1。

重复性试验：取同一批（编号为A1）样品粉末0.5 g，精密称定，平行6份，按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样分析，记录色谱图。结果各成分峰面积的RSD介于0.94%～1.16%（n＝6），表明方法重复性良好。详见表1。

加样回收试验：取已知含量的样品（编号为A1）粉末0.25 g，精密称定，平行6份，分别精密加入2.3项下混合对照品贮备液各1.0 mL，依法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样分析，记录色谱图。结果各成分平均加样回收率介于98.29%～99.06%，RSD介于1.96%～2.79%(n＝6)。详见表2。

表2 吴茱萸生品中4种生物碱加样回收试验结果（n＝6）Tab.2 Results of the recovery tests of four alkaloids in raw Euodiae Fructus（n＝6）

检测限与定量限考察：取2.3项下混合对照品溶液适量，以甲醇逐级稀释，按2.1项下色谱条件进样测定，分别以信噪比(S／N)为3∶1和10∶1计算检测限和定量限。结果去氢吴茱萸碱、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸卡品碱的检测限分别为8.62，13.70，4.64，7.31 ng，定量限分别为26.82，46.78，14.20，23.54 ng。

2.5 样品含量测定

取2.3项下供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样分析，计算并比较各炮制品及生品生物碱的含量。结果其含量依次降低，黄连水炒吴茱萸＞黄连制吴茱萸＞生品＞热水浸吴茱萸。详见表3。可见，热水浸吴茱萸会使其生物碱含量降低，黄连水炒吴茱萸的生物碱含量提升约16.87%。吴茱萸炮制前后生物碱含量比较结果见图2。

表3 吴茱萸及其炮制品中生物碱含量测定结果（mg／g）Tab.3 Content determination of alkaloids in the raw and processed products of Euodiae Fructus（mg／g）

图2 吴茱萸生品及其炮制品中生物碱含量比较Fig.2 Comparison of alkaloids in the raw and processed products of Euodiae Fructus

3 讨论

3.1 提取溶剂选择

考察了体积分数为20%，30%，50%，70%，90%的乙醇作为提取溶剂时对4种成分提取率的影响，结果提取溶剂选择体积分数为70%乙醇时4种成分提取率最大，故选用70%乙醇作为提取溶剂。

3.2 流动相选择

参考2015年版《中国药典(一部)》中吴茱萸含量测定项下方法，曾选用乙腈－四氢呋喃－0.1%磷酸溶液作流动相，但未能测定去氢吴茱萸碱及吴茱萸卡品碱的含量；考察了乙腈－水[15]、甲醇－乙腈－0.1%磷酸溶液[16]、乙腈－0.1%磷酸溶液和0.05%三乙胺溶液[17]、乙腈－0.1%甲酸溶液等为流动相时对4种成分分离效果的影响，最终参考文献[9]，以乙腈－0.1%甲酸为流动相，4种生物碱类成分的分离效果最好，基线平稳，系统压力低。

3.3 色谱柱选择

曾采用Agilent XDB C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Kromasil 100－5 C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），AgilentPoroshell120EC－C18柱（100mm×4.6mm，2.7μm）等进行测定，以Agilent XDB C18柱测得样品溶液的峰形虽好，但其保留时间较长，故未被采用；而Kromasil 100－5 C18柱测得样品溶液的保留时间虽合适，但峰形较差，故不作选择；Agilent Poroshell 120 EC－C18柱测得样品溶液中4种生物碱类成分的保留时间合适，峰形和分离度均良好，符合《中国药典》规定。

3.4 方法评价

本研究中验证了高效液相色谱法测定吴茱萸中4种生物碱类成分的可行性，方法操作简便，精密度、稳定性、重复性均良好，同时也说明不同炮制方法对吴茱萸生物碱含量有一定影响，进一步阐释了不同炮制品在临床的应用应各有侧重，可为吴茱萸的规范炮制提供参考。