基因工程在中药研究中的应用进展

陈馨 杨武华

摘要：随着现代生物技术不断地发展，基因工程技术也越发成熟，越来越多的应用到了中药的研究中，主要有中药药材基因序列的完善、中药材的鉴定、中药药效评估、调节有效成分含量、参与单体化合物的合成等方面。本文将分别论述基因工程在中药研究中的应用。

关键词：基因工程;中药;应用进展

【中图分类号】R28  【文献标识码】A  【文章编号】1673-9026（2021）09-321-02

中医药在我国具有悠久的历史，在治疗疾病的过程中有着独特的理论体系，然而更多的却并未理解这理论体系，对中医药治疗疾病存在着质疑和不解，那么中药的研究就显得尤为重要，对于中药的研究也日益增长。传统中药的特色和优势与现代生物工程技术相结合，为中药的现代化和国际化提供了契机，有利于推动中草药的发展。现代生物技术以基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程为主，本文中主要对基因工程技术在中药中的运用进行概括论述。

1.基因工程

基因工程（或称遗传工程、基因重组技术）是将不同生物的基因在体外剪切组合，并和载体（噬菌体、质粒、病毒）的DNA连接，然后转入微生物或细胞内，进行克隆，并使转入的基因在细胞或微生物内表达，产生所需要的蛋白质。基因工程作为现代生物工程技术的核心，在研究中药的过程中也占据了主导地位。

1.1基因工程与药材鉴定

中药材运用的越来越多，需求越来越多，在这需多供少的时代，药材的来源也越来越多，对于药材的质量控制，需要更多的技术鉴定，基因工程技术的应用更加具体化和可视化。石志刚[1]等人利用 psbA-trntH基因片段的保守区序列，设计引物扩增出了整个psbA-trntH基因片段，测定了扩增产物DNA碱基序，获得7个宁夏枸杞主要品种psbA-trntH基因片段的完整序列，经过分析能够鉴定出不同枸杞之间的差异，或可有利于未来枸杞的鉴定。程方婷[2]等人对不同地区生长的地黄进行DNA序列测定，选取了3个叶绿体DNA条形码片段（ psbA-trnH、matK、rbcL）、核基因ITS片段以及进化速率较快的3个候选叶绿体DNA片段（trnL-trnF、trnM-trnV和 trnS-trnG），证明trnS-trnG+ITS共同检测能够有效地区分不同地区的地黄。

随着基因技术的不断完善，已经初步形成某些药材的DNA检测试剂盒及DNA条形码技术。人参是一味及其珍贵和有效的药材，其功效甚多，但由于产少需多，人工种植的越来越多，以次充好现象盛行，大大影响了药效。周雨晴[3]等人研发了具有DNA提取及PCR鉴定的DNA检测试剂盒，用于鉴别种植参及其伪品，并发现正品人参PCR在150-200bp有单一明亮条带，将其DNA原液稀释200倍、反复冻融20次、﹣20℃保存一年对检测效果无任何影响。贝母是临床最常用的止咳药之一，川贝母善用于虚症咳嗽，道地药材的选择和准确性对于中医治疗疾病至关重要。周亭亭[4]等人运用PCR和RFLP联合使用，研制了川贝母DNA检测试剂盒，RFLP结果显示在100-250bp位置有两条条带清晰明亮的条带，准确率和稳定性均很高。李萧涵[5]等人进一步对川贝DNA试剂盒进行完善，采用分子克隆技术获得了正品川贝母特异基因序列，且进出现在100-250bp明亮清晰、无亚种条带的特异性条带，实现了川贝母特异基因序列大量的分子克隆及保存，免去了每次鉴定均要重新提取标准品的繁冗工作。王俊[6]等人选取26份血竭样品，检测ITS、ITS2、psbA-trnH、rbcL、matK、trnL（ UAA） 内含子、trnL（ UAA） 内含子的P6 环序列，从而可以鉴定血竭的真伪，但因血竭是树脂类药材，其DNA含量较少，可能会因为含量过低而无法检测，影响真伪的辨别，仍需进一步解决。汤欢[7]等人选取90个黄柏样品，获取稳定的ITS2序列，NJ树显示川黄柏和关黄柏聚为一支，其混伪品各自聚为一支，说明可以通过ITS2序列鉴别川黄柏与关黄柏及其混伪品。利用基因工技术，鉴定中药材，建立DNA条码鉴定库已经成为目前的研究趋势，也是中药材质控的重要手段，但由于产地多样化，建立健全的鑒定库也是比较困难的，需要不断地研究探索与完善。

1.2基因工程与药效评价

中药在中医学临床应用中，讲究配伍运用，君臣佐使即成方，往往不止一味中药，况且每味中药的活性成分也是种类繁多，这对于中药治疗疾病的认识以及治疗机制的研究造成了很大的困扰。基因工程技术的出现，一定程度上解决了这个问题，例如采用适当的动物模型评价药效、药代以及毒理、作用机制及靶点。基因敲除或转基因动物可以通过动物相关基因的调整从而产生适合疾病的动物模型，为中药药效评价提供了新的、相对稳定方法。目前比较成熟的模型主要有ApoE 基因敲除小鼠动脉粥样硬化易损斑块模型、MKR糖尿病小鼠模型、转基因小鼠胶原诱导性关节炎模型、flk1-EGFP转基因斑马鱼等。

林海丹[8]等人选用ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化易损斑块模型，予以温肾化痰方治疗，发现该复方可明显下调Orail、Caspase3、Caspase9、Bax 的基因及蛋白的表达，同时上调Bcl-2 的基因及蛋白的表达。表明温肾化痰方可通过降低促凋亡基因的表达及相应蛋白的激活及表达，从而降低细胞凋亡及增殖的几率，延缓甚至改善动脉粥样硬化斑块的进展。

MKR糖尿病小鼠模型是较早且较为成熟的转基因动物模型，喻嵘[9]和成细华[10][11]等人选用该模型研究左归复方对其代谢及炎症的调节作用、抗氧化应激作用、胰岛素表达与分泌的影响。发现研究表明该方具有显著的改善MKR鼠糖耐量异常、降低空腹血糖、改善高胰岛素血症的作用、保护胰岛B细胞、调节胰岛素表达和分泌、抑制氧化应激，并具有降低与炎症反应相关的细胞间黏附分子-1（ ICAM-1） 和血管细胞黏附分子（ VCAM-1） 水平的作用，从而改善MKR鼠的炎症损伤和进一步的血管损伤。

张琦[12][13]等人运用转基因小鼠胶原诱导性关节炎模型，研究桂枝芍药知母汤对类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）的疗效及机制，发现桂枝芍药知母汤可以改善关节炎的病情和症状，其机制可能是抑制C-反应蛋白（C-reactive protein， CRP）、白介素-2（Interleukin-2， IL-2）的分泌，同时抑制T淋巴细胞的增殖。

随着对基因的认识，斑马鱼已广泛用于血管生成的研究，其中在血管内皮细胞中表达增强型绿色荧光蛋白的flk1-EGFP转基因斑马鱼逐渐被开发，有助于深入研究血管发育[14]。张硕[15]等人选用flk1-EGFP转基因斑马鱼胚胎，予以高中低剂量黄芪、莪术配伍处理，发现黄芪、莪术配伍可抑制体节间血管根数、长度和面积，且黄芪、莪术配伍高剂量组抑制作用最强，还采用激光共聚焦成像观察了体节间血管顶端细胞的行为发现黄芪、莪术配伍通过抑制顶端细胞丝状伪足的伸展抑制斑马鱼血管生成。苏梅[16]等人也运用斑马鱼模型，探究脑脉利颗粒对血管新生的促进作用，发现中高剂量组有明显的促进作用，其作用机制可能与升高VEGFR1基因表达有关，脑脉利颗粒还可预防血小板聚集性血栓形成，从而预防血栓。

1.3基因工程与药材成分

药材中的有效成分是有一定固定比例的，当某些活性成分大量需求时，如何提高这个成分的含量与产量就是最直接的解决方法，有研究者已经发现与之相关基因，并调节有效成分的含量。对于某些药材，学者们也进行人工培育新品种的研究。目前主要有枸杞、枳壳、百合、刺五加、白及等中药材。

赵亚华[17]等人发现将小鼠金属硫蛋白- I cDNA通过根癌农杆菌介导转入枸杞，mM T- IcDN A成功导入枸杞组织并得到表达，转基因枸杞对锌离子富集比对照高2倍以上。贺红[18]等人采用农杆菌介导法， 将能抑制病毒侵染的外壳蛋白基因转入枳壳，，成功地获得了转外壳蛋白基因的枳壳植株。唐东芹[19]等人利用根癌农杆菌介导法将pBIXPTA基因导入百合花丝诱导的胚性愈伤组织，成功获得抗虫转基因百合植株。张佳桢[20]等人克隆刺五加香叶基焦磷酸合成酶（geranyl pyrophosphate synthase， GPS）基因的cDNA序列，并分析基因序列特征、不同器官中基因表达水平及其与皂苷含量的相关性，发现其克隆获得刺五加GPS基因的cDNA全长序列，且明确了刺五加GPS基因的表达量与皂苷含量之间存在正相关关系，为未来提高皂苷含量的研究奠定了基础。许娟[21]等人克隆成功获得白及磷酸甘露糖变位酶（PMM）基因（BsPMM）cDNA序列，检测甘露糖合成相关基因（BsPMM和BsGMP）的表达特性，发现BsPMM和BsGMP的表达具有品种、组织、时空的特性，或许是调控多糖合成代谢途径的关键基因，参与白及甘露糖和多糖的合成过程，为未来提高白及甘露糖及多糖成分奠定基石。

Olsson等[22]利用qPCR分析了青蒿素生物合成下游途径关键酶基因细胞色素P450氧化酶（cytochrome P450 monooxygenase，CYP71AV1）、紫穗槐二烯羟化酶（amorpha-4， 11-diene synthase，ADS）以及青蒿醛Δ11 （13） 还原酶（artemisinic aldehydeΔ11 （13） reductase， DBR2）僅在腺毛体顶端细胞表达，而MEP途径关键酶基因5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶（DXR）仅在近顶细胞中表达。将以上基因作为重要的靶点基因，通过基因工程改良青蒿，培育高产青蒿素转基因新品种是研究重点之一，并且取得了良好的效果。

1.4基因工程与生产中药有效化合物

利用植物作为生物反应器，获得中药材中活性成分产生的相关基因，并获得外源性基因表达产物的研究日益完善，为药材中常用活性成分的大量生产提供了基础。在我国青蒿治疗疟疾具有很悠久的历史，随着时代的发展，也逐渐为世界所接受，对于青蒿的研究也越来越多。但是由于原材料不足，对于其主要活性成分青蒿素的研究也更为关键，目前也有一些基因技术合成青蒿素，有望实现青蒿素的批量生产。青蒿素合成的相关酶主要有以下三种：法尼基焦磷酸合成酶、倍半萜环化酶、氧化酶和加氧酶。向礼恩[23]等人采用qRT-PCR技术对不同组织中青蒿素合成途径涉及到的7个功能基因（ HMGR，DXR，FPS，ADS，CYP71AV1，CPR，AAR） 的表达水平进行分析，同时测定对应组织中青蒿素含量。发现青蒿素生物合成上游途径涉及到的3 个关键酶基因HMGR，DXR，FPS在花中的表达量最高;青蒿素生物合成特有途径涉及到的4个基因功能在根、茎、叶和花中均有表达;ADS表达量在叶中最高，其次为花，在茎中表达量最低; CYP71AV1表达量在花中最高，在叶中最低;CPR的最高表达量也出现在叶中;而AAR在各个组织中表达量相对而言都较低。这些结果均表明青蒿素的合成收到多基因的双向协同作用，需要更加明确调控路径，才能高产量青蒿素。夏菁[24]等人成功从青蒿中克隆了两个新的JA信号通路负调控因子JAZ （jasmonate ZIM-domain，JAZ）基因家族成员AaJAZ5和AaJAZ6，表明青蒿 JAZ 家族成员存在着功能分化，AaJAZ5 可能是青蒿中真正参与JA信号转导通路的主效基因，对其在 JA 信号介导调控青蒿素生物合成具有指导意义。

东莨菪碱和莨菪碱主要来源于药材颠茄，龙世平[25]等人采用基于发根的基因表达系统，农杆菌介导遗传转化颠茄，潮霉素筛选获得转颠茄自身PMT和H6H基因发根;基因组PCR鉴定转基因发根;液体摇床培养后，HPLC测量莨菪碱和东莨菪碱含量;qPCR检测颠茄PMT和H6H基因表达水平。基因组PCR检测获得5个双基因共转化颠茄发根系，其中2个发根系（PH2和PH14）的总生物碱含量得到显著提高，最高的是PH2;4个转基因发根系（PH2、PH32、PH14 和 PH20）东莨菪含量都有提高，其中PH2东莨菪碱含量最高。基因表达量与生物碱含量结果基本一致，说明颠茄发根中PMT和H6H两者同时维持高水平表达可以极大程度的促进东莨菪碱积累，不仅如此，对于菪碱的合成也具有一定的指导价值。

2.讨论

随着基因工程技术不断地进步，对于中草药的认识也越加的完善，更加完善的基因库建立，使得药材的鉴别与质量控制更加便捷和准确;对中药材的药理研究提供了更加有利的技术手段，让中药材的功效可视化，更加容易理解;利用某些特异基因调控有效成分含量，提高了药物的利用度，减少原材料的浪费，同时也解决的供需不平衡的问题;转基因技术解决了有效单体产量低，不易种植培育的问题;对中药材活性成分生物合成相关基因进行研究，不仅有利于提高有效成分含量，同时还有利于实现活性成分的批量生产。相信随着时代的进步，基因工程技术会为中草药的研究与发展带来质的飞跃。

参考文献：

[1] 石志刚，万如，李彦龙，等. 宁夏枸杞主要品种 psbA-trntH 的 DNA条形码鉴定的初步研究[J]. 农业科技与装备， 2016， 6： 5–8.

[2] 程方婷， 李忠虎， 刘春艳， 等. 地黄属植物的DNA条形码研究[J]. 植物科学学报， 2015， 33（1）： 25–32.

[3] 周雨晴， 李明， 王雪松， 等. 人参DNA检测试剂盒的研制与评价[J]. 中国药学杂志， 2016， 51（21）： 1866–1870.

[4] 周亭亭， 于文静， 李成明， 等. 川贝母DNA检测试剂盒的研制与评价[J]. 中国药学杂志， 2014， 49（6）： 501–504.

[5] 李萧寒， 李成明， 周亭亭， 等. 中药材川贝母标准品特异DNA指纹片段的克隆及鉴定[J]. 中国药学杂志， 2016， 51（8）： 616-.

[6] 王俊， 刘霞， 孙伟， 等. 名贵中药材血竭的DNA条码鉴定研究[J]. 中国药学杂志， 2015， 50（15）： 1261–1265.

[7] 汤欢， 向丽， 赵莎， 等. 应用DNA条形码ITS2序列对市售药材黄柏的鉴定研究[J]. 世界科学技术-中医药现代化， 2016， 18（2）： 184–189.

[8] 林海丹， 陈铭泰， 庄震坤， 等. 温肾化痰方对ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化易损斑块模型Orai1 、Caspase、Bax、Bcl-2等基因及相关蛋白表达的影响[J]. 云南中医学院学报， 2019， 42（1）： 8–12.

[9] 喻嵘， 细成华， 吴勇军， 等. 左归复方对MKR转基因糖尿病小鼠糖代谢及相关炎症因子的影响[J]. 中国中医基础医学杂志， 2008， 14（8）： 602–604.

[10] 成细华，喻嵘， 吴勇军， 等. 左归复方对MKR转基因2型糖尿病小鼠糖代谢及抗氧化应激的影响[J]. 中草药， 2008， 39（11）： 1675–1679.

[11] 成细华，喻嵘， 李萍， 等. 左归复方对MKR转基因2型糖尿病鼠胰岛素表达与分泌的影响[J]. 中国中医急症， 2008， 17（11）： 1573–1575.

[12] 张琦， 吴轰， 江泳， 等. 桂枝芍药知母汤对转基因小鼠胶原诱导性关节炎T淋巴细胞增殖的影响[J]. 成都中医药大学学报， 2006， 29（3）： 24–26.

[13] 张琦， 吴轰， 江泳， 等. 桂枝芍药知母汤对转基因小鼠胶原诱导性关节炎CRP、IL-2的影响[J]. 中医杂志， 2005， 16（11）： 851–856.

[14] UDVADIA A J， LINNEY E. Windows into development ： historic，current，and future perspectives on transgenic zebrafish[J]. Developmental Biology， 2003， 256： 1–17.

[15] 張硕，唐德才，谭喜莹，等. 黄芪、莪术配伍对斑马鱼血管生成的影响[J]. 中华中医药学刊， 2019.

[16] 苏梅， 娄雅静， 姜雅琼， 等. 脑脉利颗粒对斑马鱼血管新生的促进及对血小板聚集性血栓形成的预防作用研究[J]. 现代中药研究与实践， 2019， 33（5）： 24–29.

[17] 赵亚华， 何平，高向阳. 根癌农杆菌介导的mMT+cDNA转化枸杞及其表达的研究[J]. 中国农业科学， 2000， 33（2）： 92–97.

[18] 贺红， 韩美丽，李耿光. 农杆菌介导转化法构建转CTV-cp的枳壳植株[J]. 中国中药杂志， 2001， 26（1）： 21–23.

[19] 唐东芹， 钱虹妹，唐克轩，等. 根癌农杆菌介导半夏凝集素基因pBIXPTA对百合的转化[J]. 上海交通大学学报， 2004， 22（2）： 135–167.

[20] 张家祯， 刑可心， 冯文绍， 等. 刺五加GPS基因克隆及表达特征与皂苷含量相关性研究[J]. 中草药， 2019， 50（5）： 1227–1231.

[21] 许娟， 石云平， 苏祖祥， 等. 白及PMM基因cDNA序列克隆及甘露糖合成相关基因的表达特性分析[J]. 南方农业学报， 2019， 50（9）： 1913–1921.

[22] OLSSON M E， OLOFSSON L M， LINDAHL A， et al. Localization of enzymes of artemisinin biosynthesis to the apical cells of glandular secretory trichomes of Artemisia annua L .[J]. Phytochemistry， 2009， 70（9）： 1123–1128.

[23] 向礼恩， 严铮辉， 王贵军， 等. 青蒿素生物合成途径基因组织表达分析与青蒿素积累研究[J]. 中国中药杂志， 2012， 37（9）： 1169–1173.

[24] 夏菁， 简东琴， 曾俊岚， 等. 青蒿JAZ基因克隆及其功能分析[J]. 药学学报， 2018， 53（5）： 812–818.

[25]龙世平， 卢 衍， 王亚雄，等. 过表达内源PMT和H6H基因对颠茄发根托品烷类生物碱合成的影响[J]. 药学学报， 2013， 48（2）： 243–249.