生物酶催化不饱和脂肪酸的硝化反应

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摘要：生物酶是一种具有专一性、特异性以及催化效率高的绿色催化剂。将其应用于工业生产之中不仅可以极大的提升工业生产效率而且可以有效避免环境污染，提高企业竞争优势。但是生物酶对使用环境的要求较高，因此如何实现低成本、高效率的应用生物酶是工业催化研究的热点之一。本文对生物酶催化不饱和脂肪酸的硝化反应进行研究，以探讨生物酶的工业化应用。

关键词：生物酶;催化作用;不饱和脂肪酸;硝化反应

1.生物催化硝化反应

相比于化学催化作用，生物酶催化作用具有专一性、特异性以及高效性的特点，且不会对环境造成污染，因此，随着生物科学研究的进步，在工业化学合成领域中的应用越来越广泛。由于发现3-NT蛋的硝化产物存在于人和动物的患病组织中，并且证明其中一些与过氧化物酶有关，这引起了人们对生物酶催化不饱和脂肪酸的硝化反应的研究，过氧化物酶是一种氧化还原酶，广泛存在于生物体中，其主要是使用过氧化氢作为电子受体来催化底物的氧化的生物酶，并通过血红素作为次要基础来参与体内细胞的代谢。随着生物酶催化不饱和脂肪酸的硝化反应研究的深入，过氧化物酶在环境、临床、食品加工和分析化学行业中起着越来越重要的作用。大量实验已证实过氧化物酶可以催化可以在温和条件下以高收率和高选择性催化生产硝基苯酚类物质。因此，过氧化物酶催化的硝化反应的不断深入研究和使用无疑将在未来生物学和化学相关领域取得重要进展。

2.酶在纳米级的固定化

酶的固定化是工业应用中高效利用酶的必要方式，其主要指的是通过特定方法将水溶性酶转化为不溶与水且以固态形式存在的活性物质。相比于生物体内的游离酶而言，酶的固定化优势很大，不仅可以方便与底物产物相互分离实现生物酶的回收利用，降低生物酶的使用成本，而且可以提高对催化反应进程的控制，保证催化反应的稳定进行。在酶的固定化中，固定化载体材料是基础，对于酶的各类性能影响较大，因此是酶的固定化研究的重点。随着纳米科学的进展，当前，用于固定化酶的载体材料已开始从最早的天然聚合物材料发展为合成聚合物材料，无机材料和复合材料。

3.生物酶催化不饱和脂肪酸的硝化反应

3.1硝基不饱和脂肪酸及其生理意义

不饱和脂肪酸是之所以被称为不饱和脂肪酸是因为具有碳双键结构，根据碳双键结构的数量分为单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸。油酸（十八碳-顺-9-烯酸）是典型的单不饱和脂肪酸，又称红油，在室温下为无色，无味，高粘度液体，不溶于水，溶于乙醇、氯仿、乙醚、苯等有机溶剂。

硝基油酸是通过硝化反应改性的生物活性物质，其中碳双键上的一个氢被硝基取代，并且烃链中的双键不被破坏，因此被称为硝基不饱和脂肪酸。对人体血浆和尿液的分析表明，人体富含硝基不饱和脂肪酸，其中，硝基油酸含量最高，研究最广泛。硝基不饱和脂肪酸的生理作用主要体现在以下三个方面：（1）硝基不饱和脂肪酸可以强烈激活被过氧化物酶增殖剂激活的γ受体（在非常低的生理浓度下可以激活），但对PPARβ和PPARβ的作用稍弱（激活需要300nM）。（2）硝基不饱和脂肪酸在体内也起NO供体的作用，在疏水环境中稳定，但在极性环境中会分解和释放NO。（3）硝基不饱和脂肪酸可用作细胞信号传递的介体并表现出亲电特性，利用烷基化NF-KB蛋白质家族p65亚基的，防止其渗透到核中并促进相关炎症基因的结合，参与基因转录和蛋白质表达，抑制肿瘤坏死因子和脂多糖诱导的促炎细胞因子在巨噬细胞和内皮细胞中的分泌，从而发挥一定的抗炎作用。此外，硝基不饱和脂肪酸还显示出强大的Nrf2/Keap1活化作用。

3.2硝基不饱和脂肪酸的化学合成

硝基不饱和脂肪酸广泛存在于生物体内，没有任何毒副作用，且生物活性非常高。如果可以通过一定的方式在体外快速有效地合成，则可以极大的促进其工业应用。但是，目前关于体外合成硝基油酸及其衍生物的研究报告较少，主要包括化学合成和酶促合成两种类型的硝基油酸，如下几种合成方式：

（1）使用油酸作为原料与氯化汞（HgCl2），溴化苯基硒和亚硝酸钠（NaNO2）以一定比例反应，反应产物被H2O2氧化和脱水，形成粗硝基油酸。然后使用多种分离和检测方法获得具有两个位置异构体（9-硝基和10-硝基）的纯硝基油酸。该方法已申请美国专利，但该方法使用剧毒的合成材料，对环境有害。

（2）通过环辛烯在8步反应中合成9-硝基-18烷-9-烯酸，然后使用壬二酸单甲酯作为起始原料在9步反应中制备10-硝基-18烷-9-烯酸。但是，由于反应步骤太复杂，产物收率很低，工业化效益不足需要进一步研究。

（3）以油酸甲酯为原料，在酸性环境中与NaNO2反应可以获得四种类型的硝基烯烃化合物，因此需要分几个阶段进行纯化。

（4）以油酸为原料，使油酸、过氧化物酶（MPO），NaNO2和H2O2在磷酸盐缓冲液中按一定比例反应，并以规则的间隔逐滴添加定量的H2O2到混合物中。反应后，分离并纯化，得到产物。这种方法产生了较多多的含有硝基醇结构的副产物。

（5）以油酸甲酯为原料，通过生物学方法过氧化物酶作为合成亚油酸甲酯的催化剂，产物非常纯净，几乎没有副产物，硝基不饱和脂肪酸的生物催化作用可以抑制副产物的形成。

3.3生物酶催化不饱和脂肪酸的硝化反应

以大豆过氧化酶为基础，利用磷酸铜纳米花载体结构固定化酶，探索生物酶催化不饱和脂肪酸的硝化反应。结果表明，硝基不饱和脂肪酸的生物催化作用可以抑制副产物的形成，提高反应效率，促进生物酶催化不饱和脂肪酸的工业生产应用。

（1）通过大豆皮提取大豆过氧化物酶，并进行提纯。利用单因素实验和正交实验法获取最佳工艺条件。并通过硫酸铵分级沉淀和丙酮分级沉淀进行提纯。相关试验表明，最佳工艺条件为料液比1：8、温度35℃、周期24h;硫酸铵分级沉淀饱和度范围为30%-80%;丙酮分级沉淀体积倍数范围为0.4-1.2。

（2）以（1）中提取的大豆过氧化酶为基础，利用磷酸铜纳米花载体结构固定化酶。并测试酶活性，将其与游离酶活性进行相比，发现该结构可以有效提高酶活性，增强强度为446%。且就可以进行循环多次利用，试验表明经过5次循环利用任具有80%的生物活性。

（3）以油酸为原料，分别以化学法和生物法合成硝酸油酸。通过红外光谱、核磁共振和液相质谱法对所得产物进行测试，以研究固定化酶的作用。结果表明硝基不饱和脂肪酸的生物催化作用可以抑制副产物的形成，值得继续深入研究以实现工业化应用。

本实验证明，化学法和生物法都可以以油酸为原料生产硝基油酸，但是化学合成法的副产物较多，需要多次纯化工艺。而硝基不饱和脂肪酸的生物催化作用可以抑制副产物的形成，但其研究仍需要进一步完善。

结束语：

纳米结构固定化载体可以固定化酶，最大化酶活性的基础上提高其利用效率，通过固定化酶应用与生物催化可以有效促进生物酶催化不饱和脂肪酸的硝化反应，并将其与化学合成领域结合起来，促进生物催化和化学合成相结合的进一步发展。

参考文献：

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[2]王志兵，赵杨，邱志举，等.豆壳过氧化物酶几种提取方法的比较研究.食品工业科技，2010，（9）：182～184

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