一种食用菌细菌性病害防治粉剂的研究

刘沛然 刘天宇 邬雅君 倪萌 袁淼

摘要：我国目前暂时没有一种专用的杀菌剂是用于食用菌细菌性病害的，但是食用菌产业病害防治依然严峻，因此开发一种专用于食用菌细菌病害的安全、稳定药剂是非常具有现实意义的。本论文提供了一种复方杀菌粉剂，通过与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的对比试验验证得到粉剂具有明显且更优的杀菌抑菌的效果的结论，且通过缓释试验及稳定性试验的测试验证了该粉剂具有较强的稳定性和保质期，并具备一定的市场应用潜力。

关键词：二氧化氯;粉剂;性能;评价

前言：

食用菌由于不适应条件，或是其他有害生物的侵染引起的发育缓慢、畸形、枯萎甚至死亡等异常现象，会降低食用菌产量和品质，此统称为食用菌病害[1]。

然而，我国对食用菌细菌性病害的研究基础薄弱，没有一种专用的杀菌剂是用于细菌性病害的，多是由医疗卫生、食品加工等领域应用的杀菌剂引申移植过来的，针对性不强，防治效果不佳。开发一种专用于食用菌细菌病害的安全、稳定杀菌剂是非常具有现实意义的。

1食用菌细菌性病害的防治

截至目前防治细菌性病害最有效的方法仍然是化学防治，被国家认证的用于食用菌病害防治的药剂仅有10种[2]。

而目前国内对食用菌子实体细菌性病害的防治常用药物有四类：第一类为多菌灵或托布津药液;第二类为克霉灵、万消灵;第三类是四环素和农用链霉素;第四类是二氧化氯[3]。

而本文涉及到的一种食用菌细菌性病害防治粉剂即使用二氧化氯作为主要的杀菌有效成分并以壳寡糖作为辅助杀菌剂。其具备良好的抑菌杀菌效果。

2粉剂制备及致病菌的提取

2.1粉剂的调配

在制备时首先采用微胶囊化技术[5]，有效实现反应组分主体材料的隔离及钝化;将处理后的活性原料组分与无水氯化钙混合制成中间体A。

其次用硫酸镁与液体的杀菌增效剂烷基糖苷制成中间体B[5]。再将A和B按比例混合后进行直接分装成粉剂。

综上可得食用菌杀菌粉剂配方组成如表1。

2.2病原菌分离纯化的实验准备

2.2.1实验仪器与材质

（1）本实验过程中所用主要仪器如下：

SW-CJ-1FD型洁净工作台

DHP-9272型恒温培养箱

DK-98-11型电热恒温水浴锅

YX-280A型压力蒸汽灭菌锅

DMS600型数码液晶生物显微镜

（2）供试褐斑病菌株从河北省灵寿县小韩楼村食用菌种植基地采集袋栽金针菇发菌之后感染褐斑病的金针菇菌袋，经分离纯化得到供试病原菌株。

供试药剂：自制二氧化氯溶液。实验室自制营养肉汤培养基与琼脂平面培养基[5]。

2.2.2 分离和确定试验以及其结果讨论

2.2.2.1 病原菌的分离纯化和确定

在无菌的超净工作台中，采用平板划线法采集金针菇菌盖上的病原菌菌种，得原始混合菌[5]。

将其培养并挑取单菌落培养并分离纯化至无异样菌落出现[5]，所得纯菌株可保存至斜面培养基备用。

将分离纯化得到的几个细菌菌株分别置于液体培养基中，用喷雾器分别喷洒并观察金针菇是否发生褐斑病。

使用单染色法进一步确定病原菌菌株类型[5]。

2.2.2.2分离纯化及确定的结果

经多次分离纯化后，得到了两种不同的菌株：A菌和B菌。

试验显示，喷洒A菌菌悬液和原症状完全相同。而接种B菌悬液没有发生病变，可初步断定A菌为致病菌。

再将两种病原菌进行单染色处理，通过显微镜观察发现：A菌为短杆状，B菌为球状。由文献查得[7]，金针菇褐斑病病原菌为一种假单胞杆菌，由此可以判断A菌为褐斑病病原菌，这与上述回接感染的结论是一致的。

3防治粉剂的性能研究

3.1抑菌性实验

3.1.1材料与方法

3.1.1.1材料与主要设备及仪器

（1）原料：实验室自制杀菌粉剂。

（2）菌种：金黄色葡萄球菌，大肠杆菌：中科院微生物研究所;实验室分离纯化所得病原菌菌种。

（3）主要设备：

LRH-250 型生化培养箱，

DHG- 9140A 型电热恒温鼓风干燥箱，

SW-CJ-1FD 型单人单面净化工作台，

DSX-280AI 型不锈钢手提式灭菌锅，

JJ-型精密电子天平。

3.1.1.2 试验方法

通过以杀菌粉剂对三种致病菌的抑制作用的结果进行对照分析研究，可直观得到杀菌粉剂对于致病菌菌种专一杀菌的优势效果。

（1）试验準备

菌悬液的制备：将大肠杆菌、金色葡萄球菌以及病原菌菌种制成1.5×108MPN/mL的菌悬液[5]。并制备两套相同的菌悬液，分别命名为A试验组和B试验组。

将实验室按配比自制的杀菌粉剂溶于无菌水中，并按照序列制备各组溶液。

（2）接种菌种

使用A试验组菌悬液，将三种菌种以无菌操作稀释一定倍数，分别取0.1mL涂布于三个相等的固体培养基，放入第一组若干相等的牛津杯，培养后测量抑菌环大小[6]。

以此组作为后续试验的空白对照组。

另准备一组牛津杯，按照上述步骤操作，将稀释好的三种菌种的稀释液放入浓度为2g/L的牛津杯中，置于培养后测量抑菌环大小。

将上述操作重复6次，完成后续序列中的杀菌粉剂试验组的菌种的接种。

使用B试验组的菌悬液，按照A试验组试验办法，完全重复一次试验操作。

（3）试验数据处理

采用spss13.软件的LSD多重比较模块进行差异显著性检验[9]。将两组实验数据进行对比分析，观察是否达到预期效果，并总结试验结论。

3.1.1.3结果与讨论

粉剂对病原菌菌种的抑制作用结果：测量A、B两试验组测量每组中每一单元的抑菌环大小。

A、B两试验组的结果分别如表2、3所示。

由表3和表4可以看出，杀菌粉剂对病原菌菌种有明显的抑制作用，并且相较于大肠杆菌和金黄色葡萄菌拥有更加出色的抑菌效果，且随着抑菌粉剂用料的升高，抑菌能力逐渐增强。另外从表中可以分析出，粉剂对革兰氏阴性菌的抑制程度高于阳性菌，其证明粉剂抑菌性对致病菌同样有优越效果。

3.2杀菌剂稳定性及缓释性测定

3.2.1稳定性

实验釆用热加速試验法测定自制杀菌粉剂的稳定性能[5]，放置前后分别测定二氧化氯的有效含量，计算有效成分下降率。

每次进行三组实验，且加速稳定性试验的结果评价以有效成分下降率不超过10%为合格[8]。

使用此方法检测粉剂，14天后测得其有效成分含量下降了7.53%，低于10%，则该二氧化氯固体杀菌剂可以储存一年。

3.2.2缓释性

将自制的食用菌细菌性病害防治粉剂配置成二氧化氯理论浓度为500mg/L的溶液，放置在室温条件下，在不同时间测试其中有效成分二氧化氯的含量，自制杀菌剂有效成分二氧化氯的浓度在24h内达到最大值。缓释型药剂可以长时间持续杀菌。

4结论

本研究主要对感染了褐斑病的金针菇做了研究，对其致病菌进行了分离纯化，确定病原菌是一种革兰氏阴性菌。且经稳定性试验验证，该配方稳定性良好，符合《消毒技术规范》对消毒剂产品的要求。以分离得到的菌株作为本研究的作用对象，并用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为对照，进行了抑菌环实验证明该自制的食用菌细菌性病害防治粉剂对金针菇褐斑病病原菌具有良好的杀灭效果，达到了试验预期的结果，是一款具有安全和稳定性质的良好杀菌剂型。

笔者认为此项发明还有待发掘的技术潜力，日后还有待进行更深入的研究，以期达到对食用菌细菌性病害的有效率达到100%，并使得食用菌产品的增产幅度达30%以上的战略目标。

参考文献：

[1] MIN H K， SEONG W P. Bacteria Phases of Pseudomonas Tolaasi for the Biological Control of Brown Blotch Disease. Korean Biochemistry， 2011， 54（）： 99-104.

[2] 刘萌松，刘胜海.食用菌病虫害综合防治.农民致富之友，2012， 20： 50.

[3] 蔡为明，金群力，冯伟林，等.金针菇细菌性斑点病的安全高效防治技术.浙江食用菌， 2007.

[4] GRANSTROM M L， LEE G F. Generation and Use of Chlorine Dioxide in Water Treatment. Joumal （American Water Works Association）， 1958： 1453-1466.

[5] 牛佳静. 食用菌细菌性病害防治药剂的开发[D].河北科技大学，2014.

[6] 冯小强，等.不同分子量壳聚糖对大肠杆菌抑制作用规律及其机理探讨[J].中国酿造，2007，（2）：16-19.

[7] KOJ L， HSUCI， LIN R H， et al. A New Fungal Immunomodulatory Protein， FIP - fve Isolated from the Edible Mushroom， Flammulina Velutipes and Its Complete Amino Acid Sequence. European Journal of Biochemistry， 1995， 228（2）： 244-249.

[8] 中华人民共和国卫生部. 消毒技术规范.北京：中华人民共和国卫生部， 2002： 124-126.

[9] 张筠，付红岩，穆晓丽. 壳寡糖对两株致病菌抑制作用的研究 [J] . 食品科技，2009 （2）：225-227.

河北科技大学化学与制药工程学院 河北 石家庄 050000