一种氯霉素高灵敏消线法检测试纸条的制备

宁军 李娜 严雨倩 付麟 周兴华

摘 要：本文对氯霉素进行丁二酸酐衍生得到半抗原，将半抗原与载体蛋白BSA偶联作为免疫原，氯霉素与偶连载体蛋白OVA作为筛选抗原，获得氯霉素单克隆抗体，IC50值为0.010 6 ng/mL，线性范围为0.002 3～0.049 5 ng/mL，特异性好，与相关药物没有交叉。在此抗原抗体的基础上制备胶体金试纸条，对鸡肉样本进行添加回收试验，消线法检测限为0.1 ?g/kg，与目前市场上主流的比色法判读试纸条相比，消线法判读更加快速，不需要使用读数仪辅助判读，为农产品质量安全提供有力保障。

关键词：氯霉素;单克隆抗体;胶体金免疫层析试纸条;消线法;检测

氯霉素（Chloramphenicol，CAP）是一种广谱抗生素，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有抑制作用。长期食用含有氯霉素的鸡肉组织会扰乱人体正常的生理功能，引起再生障碍性贫血。农业部第250号公告中明确规定氯霉素及其盐、酯在动物性食品中禁止使用，所以测定动物组织中氯霉素残留含量具有重要的意义。目前动物性食品中氯霉素残留检测方法有免疫分析方法、质谱法等。免疫学方法是农产品中抗生素残留检测中最重要的检测技术之一，具有成本低、操作简便、快速等优点，不需要辅助仪器，更适合大量样本的初筛检测。目前市场上的氯霉素试纸条，灵敏度不够高，基本上都是采用比色判读方法，试纸条上控制线和检测线差异不大，判读结果争议较大。本研究制备的氯霉素试纸条，灵敏度高，可以采用消线法判读，判读更加快速、准确，为农产品质量安全提供有力保障[1-5]。

1 材料与方法

1.1 试剂与药品

氯霉素标准品，购买自百灵威科技有限公司;牛血清白蛋白（BSA）、水溶性碳二亚胺盐酸盐（EDC HCL）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、3，3'，5，5'-四甲基联苯胺（TMB）、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、聚乙二醇溶液（50% PEG solution（w/v））、辣根过氧化酶（HRP）标记的羊抗鼠二抗、羊抗鼠抗体IgG购买自武汉博士德公司;新西兰胎牛血清，细胞基础培养液RPMI 1640，选择性培养基HAT（50×）、HT（100×），购买自Gibco公司;胶体金试纸条底板（PVC材质），硝酸纤维素膜（NC膜），吸水垫和样品垫均购买自Goldbio科技有限公司;其他实验室常用试剂均为国产分析纯，购自上海国药集团化学试剂有限公司;阴性鸡肉样本由温氏集团检测中心提供。

1.2 仪器与设备

台式高速（冷冻）离心机，湘仪仪器;高压蒸汽灭菌锅（MLS-375 1L-PC），松下健康医疗器械株式会社;磁力搅拌器（Big Squid），德国IKA;纯水机（20 TB），赛飞（中国）有限公司;液氮罐，成都金凤液氮容器有限公司;酶标仪、3111型加水套CO2培养箱、紫外-可见分光光度计Biomate 3S，Thermo Fisher Sciencetific公司;洁净工作台（BCM-1300A），苏净安泰空气技术有限公司;数显恒温水浴锅（HH-2），江苏金怡仪器科技有限公司;倒置显微镜（XD-202），南京江南永新光学有限公司;金标滑膜仪、切条机，上海金标生物科技有限公司。

1.3 实验动物和细胞

实验动物：SPF级BALB/c小鼠，6～8周龄，雌性，扬州大学医学中心;实验细胞：SP 2/0细胞，中国科学院上海生命科学研究院。

1.4 试验方法

1.4.1 半抗原衍生

氯霉素分子表面有两个自由羟基，一个伯羟基，一个仲羟基。伯羟基可以与丁二酸酐反应生成羧酸，可与蛋白偶连。5.5 mg氯霉素溶解于0.5 mL吡啶中，加入4.2 mg DMAP與2 mg丁二酸酐，50 ℃磁力搅拌反应4 h，得到衍生产物CAP-COOH。将反应产物氮吹干，溶解于水中并使用二氯甲烷萃取2次，将二氯甲烷相合并，氮气吹干，得到目标产物[6-7]。衍生步骤如图1所示。

1.4.2 完全抗原的合成

（1）免疫原合成方法。2 mg的CAP-COOH半抗原溶解于400 ?L DMF溶液中，加入1.1 mg NHS与1.8 mg碳二亚胺EDC，室温条件下磁力搅拌反应2 h，得到活性酯。随后将活性酯逐滴加到5 mg BSA溶液中，室温磁力搅拌过夜。将最终产物装入透析袋中，在0.05 mol/L PBS溶液中透析

3 d，每4～8 h更换一次透析液。透析结束后分装小份，

-20 ℃保存[8-10]。

（2）包被原合成方法。氯霉素上游离的羟基通过CDI法与蛋白偶联，3 mg CAP溶解于0.5 mL无水DMSO试剂中，加入2 mg CDI，室温磁力搅拌反应20 min。向反应液中加入100 ?L超纯水终止反应。随后将活化产物逐滴加到5 mg OVA蛋白溶液，室温条件下磁力搅拌反应4 h。偶联产物在0.05 mol/L PBS溶液中透析3 d，每4～8 h更换一次透析液[11]。透析结束后分装小份，-20 ℃保存。

1.4.3 小鼠免疫及血清筛选

使用合成的完全抗原CAP-COOH-EDC-BSA作为免疫原进行小鼠免疫实验，CAP-CDI-OVA作为包被原进行筛选实验。每个免疫原选取4只BALB/c小鼠进行免疫。采用间接竞争ELISA方法[12-13]测定小鼠血清效价与抑制效果，具体步骤如下。

（1）包板。用包被缓冲液将包被原（CAP-CDI-OVA）稀释到适宜浓 度，加入到96孔酶标板（100 ?L/孔）中，37 ℃下孵育2 h。孵育结束后甩出酶标板中液体，加入洗涤缓冲液（含0.05% 吐温 20的0.01 mol/L PBS，200 ?L/孔），静止3 min后甩出，拍干，重复洗涤3次，拍干。

（2）封闭。每孔中加入200 ?L封闭液，4 ℃过夜，洗涤液改为250 ?L洗涤3次，拍干。

（3）一抗。使用棋盘法同时测定小鼠的血清效价与抑制。使用洗涤缓冲液作为阴性对照（50 ?L/孔），检测组加入适宜浓度的标准品溶液（50 ?L/孔）。处理好的小鼠血清从

1 000倍用抗体稀释液进行梯度稀释（1 000、3 000、9 000、27 000倍），分别对应加入对照组与检测组中，37 ℃下孵育30 min，洗涤3次同上，拍干。

（4）二抗。将HRP二抗用洗涤缓冲液稀释3 000倍，然后每孔加入100 ?L，37 ℃下反应30 min，洗涤3次同上，拍干。

（5）显色。使用前将A液与B液按1∶1配制，混匀后加入酶标板（100 ?L/孔），37 ℃下避光显色15 min。

（6）终止。酶标板中每孔加入50 ?L终止液，使用酶标仪测量450 nm、620 nm下吸光值，最终结果按照OD450 nm-OD620 nm保存数据。

1.4.4 细胞融合及抗体制备

筛选效果较好的小鼠进行细胞融合试验。①SP 2/0细胞的复苏与扩大培养;②小鼠脾脏细胞融合。小鼠脾细胞与SP 2/0细胞混合均匀，比例为5∶1，采用PEG 1500进行细胞融合试验;③杂交瘤细胞的培养与筛选。细胞融合后第7 d进行细胞上清检测，挑选OD值高，抑制率高的孔进行亚克隆，使用有限稀释法进行3次亚克隆，挑选出单团杂交瘤细胞转移至培养瓶中进行扩大培养，最后转移至液氮储存箱中保存[8]。

采取体内诱生腹水瘤法制备细胞株腹水抗体，再使用辛酸-硫酸铵法进行抗体纯化[11]。

1.4.5 单克隆抗体的评价

采用间接竞争法，分别测定所制备单克隆抗体对氯霉素与其结构类似物（氟苯尼考、甲砜霉素）的IC50值。交叉反应率（Cross-reactivity，CR，%）=（氯霉素IC50值/类似物IC50值）×100%[6，13]。

1.4.6 胶体金试纸条的制备

按照柠檬酸三钠还原法制备金纳米粒子，采用0.1mol/L碳酸钾溶液进行抗体标记，标记量分别为6 ?g/mL、8 ?g/mL、10 ?g/mL和12 ?g/mL，10% BSA封闭，0.01 mol/L pH 8.5硼酸缓冲液（含0.25% BSA，3%海藻糖，1%吐温20）复溶，按照50 ?L每孔加入到微孔板中，冻干，密封保存。

试纸条主要由PVC底板，NC膜，样品垫和吸水纸组成。将羊抗鼠抗体（靠吸水纸端）和抗原（靠样品垫端）按照一定的浓度划到硝酸纤维膜上，分别构成试纸条质控线（C线）和检测线（T线），随后将试纸条在37 ℃下烘箱中烘干过夜[14-16]。

在靠近C端贴上吸水纸，靠近T线端贴好样品垫。切成4 mm宽度。检测时，将待检测液体加入微孔中，反应3 min后，插入试纸条，5 min后判读。

1.4.7 添加回收试验

对鸡肉阴性样本进行氯霉素添加回收试验。阴性对照组添加不含标准品空白溶剂作为对照。具体操作如下：取4 g均质后的样品，添标浓度分别为0、0.05 ?g/kg、0.10 ?g/kg和0.20 ?g/kg，加入7 mL乙酸乙酯，剧烈振荡5 min，4 000转离心5 min。取4 mL上清，氮气65 ℃吹干后，再加入2 mL正己烷和0.4 mL 0.01 mol/L PBS，振荡1 min，离心3 min，去除上层，取下层溶液100 μL点样。

2 结果与分析

2.1 完全抗原的合成与表征

氯霉素半抗原、载体蛋白（BSA和OVA）及合成的免疫抗原和包被抗原分别使用0.01 mol/L PBS稀释至合适的浓度，使用紫外-可见分光光度计在200～450 nm范围内进行扫描，结果如图2所示。

如图2所示，两种载体蛋白的紫外特征峰均位于278 nm左右，偶联物CAP-COOH-EDC-BSA紫外吸收较同浓度的BSA有明显增强且有略微偏移。同样，偶联物CAP-CDI-OVA紫外吸收较同浓度OVA也有明显增强，紫外表征结果显示氯霉素半抗原成功的与载体蛋白进行了偶联。

2.2 单克隆抗体的评价

通过对小鼠血清进行ELISA检测，筛选效价高、抑制率高的小鼠进行细胞融合实验。通过阳性筛选与3次亚克隆，得到针对氯霉素的杂交瘤细胞株（6 E2），并制取腹水，纯化后得到氯霉素单克隆抗体[11]。

采用棋盘法，筛选出氯霉素单克隆抗体的最佳工作点，即包被浓度0.03 ?g/mL、抗体浓度0.25 ?g/mL，然后以不同浓度的氯霉素标准品溶液（0、0.003 ng/mL、0.010 ng/mL、0.030 ng/mL、0.090 ng/mL和0.270 ng/mL）建立標准曲线，其标准曲线如图3所示，其IC50值为0.010 6 ng/mL，线性范围（IC20～IC80）为0.002 3～0.049 5 ng/mL，相关系数为0.999 0。

通过ic-ELISA方法测定氯霉素单克隆抗体的交叉反应，检测结果如表1所示，氯霉素单克隆抗体具有特异性，对氟苯尼考和甲砜霉素交叉均在1%以下。

2.3 胶体金试纸条的制备

使用不同包被浓度和抗体标记量进行试验，确定最优条件C线划膜浓度为0.5 mg/mL、T线划膜浓度为0.2 mg/mL和抗体标记量为10 ?g/mL。如图4所示，使用肉眼观察时，氯霉素金标试纸条消线值为0.1 ?g/kg。

2.4 实际样本添加回收试验

采用以上前处理方法，使用阴性样品添加试验确定该方法灵敏度。4种阴性鸡肉样品氯霉素添加水平为0、0.05 ?g/kg、0.10 ?g/kg、0.20 ?g/kg。结果如图5所示，使用肉眼观察时，氯霉素消线法的检测限为0.1 ?g/kg。

3 结论

本文采用一种完全抗原对小鼠进行免疫，成功制备了一种氯霉素单克隆抗体，IC50值为0.010 6 ng/mL，特异性好，与相关药物没有交叉。在此抗原抗体的基础上制备胶体金试纸条，对鸡肉组织样本做了添加回收试验，消线法检测限为0.1 ?g/kg，该方法成本低、灵敏度好、操作方便快速，判读方式简单，对鸡肉中氯霉素残留的监控有重要意义。

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