化妆品中新补骨脂异黄酮、补骨脂二氢黄酮、补骨脂素和异补骨脂素含量的测量不确定度评定

范 菲，黄炯力，安 庆，崔 颖，朱 清

（1.西安市食品药品检验所，陕西 西安 710054；2.西安计量技术研究院，陕西 西安 710068）

1 引言

补骨脂素为光敏化合物，在日光照射的情况下，可导致受照处的皮肤发生红肿，并且增加色素；异补骨脂素在吸入、接触皮肤以及吞食的情况下都是有害的［1，2］。文献［3～6］中主要报道了新补骨脂异黄酮、补骨脂素、补骨脂二氢黄酮和异补骨脂素的检测方法，并未研究其测量不确定度；然而测量不确定度能够定量表征检测结果的质量，很大程度上决定了其测量结果的可用性。新补骨脂异黄酮、补骨脂素、补骨脂二氢黄酮和异补骨脂素被我国化妆品安全技术规范［7］列为禁用物质，其测定结果的准确性尤为重要，测量不确定度评定在质量的控制方面意义重大，是日常检验检测工作的重要组成部分。

本实验参考相关文献［8～15］，对新补骨脂异黄酮、补骨脂素、补骨脂二氢黄酮和异补骨脂素的高效液相含量测定方法进行了不确定度评定，建立了数学模型，量化了各不确定度的分量，为评定检验检测结果的准确性提供了科学依据。

2 实验部分

2.1 试剂与仪器

对照品：新补骨脂异黄酮（中国食品药品检定研究院，批号：520052-201401）；补骨脂素（中国食品药品检定研究院，批号：110739-201617）；补骨脂二氢黄酮（中国食品药品检定研究院，批号：520053-201401）；异补骨脂素（中国食品药品检定研究院，批号：110738-201715）。

安安金纯橄榄油深层水嫩晶透紧肤水（佛山市安安美容保健品有限公司，批号：II05B，简称紧肤水）；甲醇；乙腈（色谱纯，赛默飞世尔科技公司）；无水乙醇（色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；三蒸水（自制）；其他分析纯试剂。

测试仪器：MS105型万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；BSA124S-CW 型千分之一电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；HC-3018R高速冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；ULTIMATE 3000型高效液相色谱仪（Thermo Fisher Scientific）；涡旋混匀器（德国IKA）。

2.2 方法

2.2.1 制备溶液

对照品储备溶液：精密称重新补骨脂异黄酮对照品5.45 mg、补骨脂素对照品5.47 mg、补骨脂二氢黄酮对照品5.65 mg、异补骨脂素对照品5.36 mg，置50 mL量瓶中，用甲醇溶解稀释到刻度，即得。

标准系列工作溶液：分别量取上述混合对照品储备液各1 mL、5 mL、10 mL、20 mL置于100 mL量瓶中，作为②、③、④、⑤号标准溶液，加甲醇稀释到刻度；再精密吸取②号液1 mL，置10 mL量瓶中，得①号标准溶液，加甲醇稀释到刻度；最终得①、②、③、④、⑤号标准系列工作溶液。

供试品溶液：精密称取0.5 g供试品置10 mL具塞比色管中，加6 mL甲醇，涡旋使提取溶剂与试样混匀，超声20 min，放冷，加甲醇至刻度，转移到10 mL具塞离心管中，离心5 min（11 000 r／min），上清液经0.45μm滤膜过滤，即得。

2.2.2 色谱条件

安捷伦5 TC-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相为乙腈（ACN）-乙酸水溶液（0.1%），进行梯度洗脱（0～2 min，30%ACN；2～12 min，30～70%ACN；12～13 min，70～90%ACN；13～15 min，90%ACN；15～16 min，90～30%ACN；16～20 min，30%ACN）；检测波长为246 nm；流速为1.0 mL／min；柱温箱温度为30℃；进样量为10μL。

3 建立数学模型与不确定度的来源

3.1 建立数学模型

根据保留时间测其峰面积，再由标准曲线计算得到待测溶液中新补骨脂异黄酮、补骨脂素、补骨脂二氢黄酮和异补骨脂素的质量浓度，由式（1）计算得到待测组分的含量（质量比）。

式中：w为待测组分的含量（质量比），μg／g；m为样品称重，g；ρ为标准工作曲线算得待测组分的质量浓度，μg／mL；V为样品定容体积，mL。

各组分含量的不确定度除了受式（1）中ρ、m和V的影响外，样品处理过程中的一致性和均匀性也会对含量产生影响，应该加以考虑。

3.2 确定测量不确定度的来源

通过分析数学模型，确定测量不确定的来源如下：

（1）对照品引入的不确定度：对照品称重引入的不确定度u（mst）、玻璃量器转移引入的不确定度u（Vst）、标准工作曲线引入的不确定度u（Cst）。

（2）样品引入的不确定度：样品称重引入的不确定度u（msa）、样品定容引入的不确定度u（Vsa）、样品重复性引入的不确定度u（c）、回收率引入的不确定度u（R）。

（3）液相色谱仪引入的不确定度u（rHPLC）。

测量模型中，由于输入量估计值相互独立，所以合成相对标准不确定度urel的计算公式如下：

由式（2）可推导出样品的相对合成标准不确定度为：

4 量化测量不确定度分量

4.1 对照品引入的不确定度

4.1.1 对照品纯度引入不确定度u（mst）

采用十万分之一天平称重对照品，则不确定度的分量包括天平最大示值误差u（m1）、分辨力u（m3）（示值可读数）、重复性u（m2）、偏载u（m4）等的影响。从对照品的证书查得新补骨脂异黄酮、补骨脂二氢黄酮、补骨脂素和异补骨脂素的纯度分别为99.6%、99.4%、99.7%和99.5%，由于证书没有给出对照品的误差范围，忽略不计。另外，环境温度、重力加速度、大气浮力均可忽略不计。经查计量检定证书，计算各分量的标准不确定度，见表1。

减重法存在二次称重，因此表1中4项的合成标准不确定度为：

表1 电子天平（d＝0.01 mg）各分量的标准不确定度Tab.1 Standard uncertainty of each component for electronic balance（d＝0.01 mg）measurement mg

已知称取新补骨脂异黄酮（N）、补骨脂素（P）、补骨脂二氢黄酮（B）和异补骨脂素（L）对照品分别为5.45 mg、5.47 mg、5.65 mg和5.36 mg，则对照品称重引入的相对标准不确定度分别为：

4.1.2 玻璃量器转移引入的相对标准不确定度urel（Vst）

玻璃量器转移引入的不确定度由3个部分组成：容量允差u（V1）、估值误差u（V2）、液体温度和液体膨胀系数u（V3）。

urel（V1）：根据JJG 196—2006专用玻璃量器检定规程，10 mL量瓶的容量允差为±0.020 mL，根据三角分布考虑，其相对标准不确定度为

urel（V2）：10 mL量瓶的估值误差为0.05 mL，根据三角分布考虑，其相对标准不确定度为

urel（V3）：甲醇体积膨胀系数是1.2×10－3／℃，实验室温度在±5℃之间变动，根据均匀分布考虑，其相对标准不确定度为

综合上述3个分量，得10 mL容量瓶引入的相对合成标准不确定度为：

同理计算出其它玻璃量器转移引入的相对标准不确定度，见表2，最终得

表2 玻璃量器的不确定度Tab.2 Uncertainty of each volumetric glassware mL

4.1.3 拟合标准工作曲线引入的相对不确定度urel（Cst）

精密吸取标准系列工作溶液，进行测定，以峰面积和工作溶液浓度进行线性拟合，见表3。

表3 标准系列工作溶液校准结果Tab.3 Results of calibration for standard solutions

根据拟合曲线，算得样品中新补骨脂异黄酮、补骨脂素、补骨脂二氢黄酮和异补骨脂素平均浓度C所产生的不确定度为：

式中：s（A）为标准系列工作溶液峰面积的标准偏差；为标准系列工作溶液平均质量浓度，μg／mL；C为样品溶液平均质量浓度，μg／mL；N为平行测定的次数，N＝2；a为标准曲线斜率；n为标准系列工作溶液测定的次数，n＝2×5＝10。

将各值代入公式（4），计算得到u（C），再由公式（5）计算得到由标准曲线求得样品浓度引入的相对标准不确定度。

4.2 被测样品引入的不确定度

4.2.1 称量被测样品引入不确定度urel（msa）

使用万分之一电子天平称重样品，按照4.1.2节中的过程进行计算，各分量的不确定度见表4。

减重法存在二次称重过程，则表4中4项合成的标准不确定度为

表4 电子天平（d＝0.1 mg）各分量的标准不确定度Tab.4 Standard uncertainty of each component for electronic balance（d＝0.1 mg）measurement mg

精密称取样品0.525 5 g和0.515 4 g两份样品，则称重引入相对标准不确定度为

4.2.2 定容被测样品引入不确定度urel（Vsa）

根据JJG 10—2005专用玻璃量器检定规程，10 mL比色管容量允差是±0.10 mL，按三角分布考虑，则相对标准不确定度为

充满液体至刻度的估值误差是0.5 mL，按三角分布考虑，其相对标准不确定度为

最终合成得到相对标准不确定度为

4.2.3 样品重复性引入不确定度urel（c）

精密称取样品10 g，精密加入对照品储备溶液4 mL，混合均匀，在重复条件下，精密称取样品6份，各测定2次（n＝6，N＝2）。由式（6）、式（7）计算得到相对标准不确定度，结果见表5。

表5 样品重复性结果（n＝6）Tab.5 Repetitive test results of samples（n＝6） μg·mL－1

4.2.4 回收率引入相对不确定度urel（R）

精密称取空白样品6份，进行了加标回收实验，分别测定2次（N＝2，n＝6）。由式（8）、式（9）计算得到相对标准不确定，结果见表6。

表6 回收率结果（n＝6）Tab.6 Repetitive test results of recovery（n＝6） （%）

4.3 液相色谱仪引入的不确定度urel（rHPLC）

经查校准证书可知，液相色谱仪二极管阵列检测器的不确定度为0.21%，按均匀分布考虑，则相对标准不确定度为

4.4 评定测量不确定度

4.4.1 相对合成标准不确定度

把各不确定分量代入式（3），计算得出相对合成标准不确定度urel（x）。

4.4.2 扩展不确定度

根据模型和重复性实验结果，计算6份化妆品中新补骨脂异黄酮、补骨脂素、补骨脂二氢黄酮和异补骨脂素的含量均值w，取包含因子k＝2（置信概率95%）。按公式（10）计算得到的液相色谱法测定化妆品中新补骨脂异黄酮、补骨脂素、补骨脂二氢黄酮和异补骨脂素的扩展不确定度分别为1.65μg／g、1.82μg／g、1.66μg／g和1.61μg／g。

4.5 不确定度报告

液相色谱法测定化妆品中新补骨脂异黄酮、补骨脂素、补骨脂二氢黄酮和异补骨脂素的含量分别为：

5 结论

对化妆品中4种禁用成分的不确定度分量进行了分析，结果表明7个不确定度因素均可以不同程度影响到化妆品中新补骨脂异黄酮、补骨脂素、补骨脂二氢黄酮和异补骨脂素的含量测定结果。其中标准曲线拟合为主要因素；对照品、样品称量及移液定容引入不确定度其次；样品纯度、回收率、重复性引入不确定度均较小。可以采用增加系列标准溶液的标准点数；定期检定和维护实验仪器及量器，使其保持较高的灵敏度，或者将移液定容改为天平称量；从而降低测量不确定度。

如果样品基质复杂，可采用内标法测定，从而降低基质引入的不确定度。本次试验对20批化妆品进行检测，均未检出新补骨脂异黄酮、补骨脂素、补骨脂二氢黄酮和异补骨脂素4种物质。考察样品时使用加标样品，建议在今后的工作中，配制的工作曲线的标准点的浓度应该尽量接近被测组分的浓度，以降低标准工作曲线变动引入的不确定度。