CMS-D2 恢复基因对陆地棉主要性状的影响

左志丹，张梦，张学贤，吴建勇，郭立平，戚廷香，唐会妮，邢朝柱

（中国农业科学院棉花研究所/ 棉花生物学国家重点实验室/ 农业农村部棉花生物学与遗传育种重点实验室，河南 安阳455000）

棉花杂种优势利用是大幅度提高棉花产量、改善棉花纤维品质以及增强棉花抗逆性的有效途径之一。目前生产上推广的棉花杂交种以人工去雄授粉制种为主，用工量大、成本高，难以为继，已成为棉花杂种优势大规模利用的瓶颈，严重制约杂交棉生产应用。 利用哈克尼西棉细胞质雄性不育系（CMS-D2），采用“三系法”（不育系、保持系和恢复系）制种，不仅操作简单，而且省工省时，是棉花杂种优势利用的主要发展方向。 研究表明，创制和选育性状优良、恢复能力强的恢复系是培育强优势三系杂交棉的关键[1-4]。

前人对恢复基因的研究主要集中在恢复基因的定位和克隆方面，但较少研究恢复基因对棉花性状的影响。 因此，本研究通过1 对同质异核的哈克尼西棉恢复基因近等基因系材料 （保持系和恢复系）系统研究恢复基因在不同生态环境下对棉花苗期生长性状、 全生育期主茎功能叶光合生理指标、高温胁迫下花药发育状况、产量及纤维品质性状的影响，为创制优良的恢复系、培育强优势“三系”杂交种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究以基因型为N（rr）的保持系ZB 为轮回母本，通过与基因型为S（RR）的恢复系ZBR 连续回交10 代得到基因型为N（Rr）的单株。 该单株自交后，利用本课题开发的分子标记InDel-1892[5]鉴定出基因型为N（RR）的单株。 基因型为N（RR）的单株和保持系ZB 分别自交，最终得到仅在恢复基因位点存在差异的近等基因系： 基因型为N（RR）的恢复系NR 和基因型为N（rr）的保持系NB。

1.2 试验设计

将上述2 个材料于2020 年4 月下旬分别种植于黄河流域棉区的河南省安阳县中国农业科学院棉花研究所东场试验基地 （114°35′E，36°10′N）和长江流域棉区的江西九江柴桑区江西省棉花研究所试验基地（115°25′E，29°26′N）。 安阳点采用直播方式，行距80cm，株距23.8cm，密度45000 株·hm－2，小区面积28.8 m2。 九江点采用营养钵育苗移栽方式，行距100 cm，株距37 cm，密度22 500 株·hm－2，小区面积34.0 m2。 本试验采用随机区组设计，3 次生物学重复，共6 个小区，四周均设保护行，田间管理措施参照当地普通大田。

1.3 测定指标及方法

1.3.1苗期生长参数测定。 设置苗圃，在安阳和九江将2 个材料按1 行区3 个重复播种，每行30 株。在苗期（大约5 叶期）用直尺测量所有植株高度，然后拔出棉株用电子天平测定植株鲜物质质量，最后将棉株样品在恒温箱中105 ℃杀青1 h，再于80 ℃烘干至质量恒定，称量其干物质质量，计算单株平均值。

1.3.2叶片光合作用参数测定。 2020 年6－10 月，分别于苗期、 蕾期、 花铃期和吐絮期， 采用美国LI-COR 公司生产的便携式LI-6800 型光合测定仪，在田间测定棉花主茎功能叶（选取相同部位完全展开的倒3 叶）净光合速率、气孔导度、蒸腾速率和胞间CO2浓度等光合参数。 测定选在晴天上午9:00－11:00， 设定CO2浓度为400 μmol·m－2·s－1，流量为700 μmol·s－1。 测定时采用仪器配备的内置人工光源，光照度为80 000 lx，相对湿度为60%～80%。 每个材料设3 个重复（小区），每个小区随机选取长势一致的连续10 株棉花， 取其平均值作为该材料的光合作用参数结果。

1.3.3花药育性测定。 于盛花期，分别在安阳点的相对高温期（7 月22－26 日）以及九江点相对高温期（7 月2－6 日）对花药发育状况进行田间调查和室内测定。 主要指标包括花粉量、花粉活性和花粉活力，分别用多粉花率、可育花粉率和花粉体外萌发率来表示。 其中，各参试材料花朵花药散粉情况调查标准及多粉花率统计方法参照本实验室前期的研究[6]。 花粉活力测定和可育花粉率统计方法参照李雪等[7]的研究。 花粉体外萌发试验方法参照胡启瑞等[8]的研究。

1.3.4产量及纤维品质性状测定。 9 月中下旬于吐絮期前进行株数和铃数调查，单株结铃数及产量计算参照李雪等[7]的方法。 纤维品质性状由农业农村部棉花品质监督检验测试中心（河南安阳）测定，使用HVI900 检测仪检测纤维品质5 项指标：纤维上半部平均长度、长度整齐度指数、断裂比强度、马克隆值和断裂伸长率。

1.4 统计分析

试验数据用Microsoft Excel 整理、 制表和绘图，利用IBM SPSS statistics 25.0 软件进行t检验，并采用最小显著差数法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 恢复基因对棉花苗期生长性状的影响

试验结果（图1～图3）表明，在安阳点和九江点，恢复系NR 苗期株高、鲜物质质量和干物质质量均低于保持系NB，但差异不显著，说明哈克尼西棉细胞质雄性不育恢复基因对苗期生长无显著影响。 但九江点NB 和NR 苗期株高、鲜物质质量和干物质质量均明显高于安阳点，这可能与九江点棉花生长较快有关。

图1 保持系和恢复系苗期株高比较

图2 保持系和恢复系苗期单株鲜物质质量比较

2.2 恢复基因对棉花光合生理指标的影响

对棉花整个生育期主茎功能叶蒸腾速率、净光合速率、胞间CO2浓度和气孔导度进行比较分析，结果（表1）表明：恢复基因对棉花主茎功能叶净光合速率无显著影响。 无论在安阳点还是在九江点，保持系NB 和恢复系NR 净光合速率在全生育期均表现出先升高后降低的趋势，在花铃期达到峰值。

表1 保持系和恢复系全生育期主茎功能叶片光合特性比较

在安阳点和九江点，恢复系NR 苗期的净光合速率均低于保持系NB；花铃期和吐絮期的净光合速率均高于NB，但差异均不显著。 安阳点，NR 蕾期的蒸腾速率极显著低于NB，降低了22.53%，NR吐絮期的蒸腾速率显著高于NB， 增幅为10.56%；NR 花铃期胞间CO2浓度极显著高于NB， 增幅为52.98%。 九江点NB 和NR 苗期和吐絮期气孔导度有显著差异，这可能是由于生态环境不同导致部分光合生理指标出现差异。

2.3 恢复基因对棉花花药发育状况的影响

在安阳点和九江点， 在高温胁迫下恢复系NR多粉花率和可育花粉率均高于保持系NB， 花粉体外萌发率则呈现相反趋势，但差异均不显著（图4～图6）。 说明在无哈克尼西棉不育胞质存在时，恢复基因对高温胁迫下棉花花药正常发育无显著影响。

图4 保持系和恢复系多粉花率比较

图5 保持系和恢复系间可育花粉率比较

图6 保持系和恢复系花粉体外萌发率比较

2.4 恢复基因对棉花产量及其构成因素的影响

在九江点，恢复系NR 的铃重极显著低于NB，较NB 降低了6.03%；衣分显著高于NB，较NB 增加5.18%（表2）；而单株结铃数、籽棉产量、皮棉产量与NB 无显著差异。 在安阳点，保持系NB 和恢复系NR 的铃重、籽棉产量和皮棉产量差异均达到显著水平，其中NR 的铃重、籽棉产量和皮棉产量较NB 分别增加了12.41%、9.64%和10.92%。 上述结果表明，在黄河流域恢复基因对棉花产量具有一定的促进作用。

表2 保持系和恢复系间产量及产量性状比较

2.5 恢复基因对棉花纤维品质的影响

在安阳点和九江点， 恢复系NR 与保持系NB的纤维上半部平均长度差异显著，较NB 分别增加5.34%和4.64%； 其他4 个纤维品质指标无显著差异（表3）。 说明恢复基因可以显著增加棉花纤维长度，而对其他4 个纤维品质性状无显著影响。

表3 保持系和恢复系间纤维品质性状比较

3 讨论与结论

棉花苗期以营养生长为主，通常以株高、棉株干物质质量和鲜物质质量这3 个性状作为苗期营养生长重要参考指标[9]。 在黄河流域和长江流域两大棉区，恢复基因对棉花苗期营养生长、净光合速率、花药发育无显著影响，对籽棉产量、皮棉产量和纤维长度具有促进作用，但只有黄河流域棉区的籽棉产量、皮棉产量的差异达到显著水平。 恢复系棉花产量提高的原因可能是哈克尼西棉恢复基因具有一因多效的作用。前人研究指出，在高粱中，CMS恢复基因和产量相关的数量性状位点共定位，说明恢复基因具有一因多效， 不仅可以恢复不育系育性，还对高粱产量形成具有一定影响[10]。黄河流域棉区和长江流域棉区恢复系与保持系棉花产量增幅的差异可能是由于长江流域温度高，恢复基因的促进作用被抑制。前人研究指出小麦和棉花恢复基因的恢复能力受温度的影响，在高温环境下恢复系的恢复能力明显降低[11-14]；因此，结合本研究的结果， 推测温度不仅影响恢复系恢复育性的能力，而且影响恢复基因对棉花产量的促进作用。本研究还发现恢复基因可以显著增加棉花的纤维长度，这是一个值得关注的现象，可能是由于恢复基因本身作用或者恢复基因与其他修饰基因的互作所致[15]，具体的分子作用机制有待进一步研究。尽管本研究仅通过1 对近等基因系材料，1 年2 个生态点的试验数据研究恢复基因对棉花主要性状的影响，但是研究结果仍然可以为后续恢复基因效应研究提供参考。