微小RNA-34a对强直性脊柱炎滑膜成纤维细胞成骨分化的影响

宫树一 王景续 穆胜凯

强直性脊柱炎(AS)是一种病程长和致残率高的自身免疫炎症性疾病，其中骶髂关节和中轴关节病变是其典型的病理特征，过度的骨形成可引起关节强直和脊椎畸形，影响患者的生活质量[1-3]。成纤维细胞是脊柱韧带和关节滑膜的主要成分，具有分化为成骨细胞的巨大潜能，是AS脊柱关节发生骨化的主要细胞[4]。目前，关于AS发生与发展的机制尚不清楚。因此，深入探讨AS成纤维细胞成骨分化的分子机制，寻找抑制成纤维细胞成骨分化的有效分子靶点对治疗AS具有重要意义。随着研究的不断深入，许多微小RNAs(miRNAs)在成骨分化和骨形成中的作用已被发现[5]。有报道[6]证实，miRNA-34a在炎症条件下可抑制成骨样细胞成骨分化，但其具体作用机制尚未阐明。因此，本研究通过观察miRNA-34a在AS滑膜成纤维细胞中的表达情况，并探讨miRNA-34a对细胞成骨分化的影响及其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 标本来源

收集2017年10月至2019年5月于本院行髋关节置换手术的5名AS患者的滑膜组织标本，年龄26～48岁，男4例，女1例；患者均符合纽约诊断标准(1984年修订)。另收集5例创伤性骨折患者的滑膜组织作为对照，其中年龄介于46～55岁，男3例，女2例。所有受试者均排除髋关节滑膜炎和风湿病等，组织标本的收集均获得患者及家属的知情同以及本院伦理委员会批准，且均储存于-80 ℃下备用。

1.2 主要试剂

DMEM培养基购于美国Gibco公司，胎牛血清购于杭州四季青公司，脂质体2000、胰蛋白酶、Trizol试剂、cDNA逆转录试剂盒和实时-PCR试剂盒购于美国Invitrogen公司。青链霉素双抗购于美国Thermo公司，转化生长因子-β1(Transforming Growth Factor-β1，TGF-β1)和骨形态发生蛋白2(Bone Morphogenetic Protein 2，BMP2)购于美国Sigma公司。Notch信号通路激活剂rhNF-κB购于美国Progmega公司。BCIP/NBT溶液购于中国华兴博创生物公司。RNA提取试剂盒购于德国QIACEN公司，miRNA-34a mimics(F：5′-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-3′和R：5′-AACCAGCUAAGACACUGCCAUU-3′)及其阴性对照序列(F：5′-CAGUACUUUUGUGUA-GUACAA-3′和R：5′-UUGUACUACACAAAAGU-ACUG-3′)购于广州锐博生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1滑膜成纤维细胞的体外培养 采用组织块贴壁法。以无菌的D-Hanks溶液洗涤组织标本后，采用含1%青链霉双抗的DMEM培养基以自然沉降法对剪碎的组织小块(体积1 mm3)浸洗3次。收集组织块接种于含有20%胎牛血清和1%青链霉双抗的DMEM 培养基的培养瓶中，于5% CO2、37 ℃恒温细胞培养箱中培养4 h至组织块贴壁。继续培养72 h后，有细胞游出。当细胞铺满瓶底85%时，以0.25%胰蛋白酶消化、传代。收集生长良好的第四代对数生长期细胞进行实验。

1.3.2细胞分组与转染 实验分组：滑膜成纤维细胞分为正常组、AS对照组、AS+NC组和AS+miRNA-34a mimics组，实验处理：其中除正常组外，各组细胞均AS患者的成纤维细胞，而正常组为来自创伤性骨折患者的正常成纤维细胞。AS+NC组和AS+miRNA-34a mimics组的细胞培养基添加有5 ng/mL TGF-β1和7 ng/mL BMP-2，并参照脂质体2000说明书步骤将终浓度为50 nmol/L miRNA-34a mimics及其阴性对照转染至细胞中，转染48 h后，继续培养24 h收集各组细胞进行后续实验。后期实验另设AS+miRNA-34a mimics+rhNF-κB组：采用含5 ng/mL TGF-β1和7 ng/mL BMP-2的培养基进行培养，以miRNA-34a mimics转染滑膜成纤维细胞48 h后，给予浓度为1 g/mL的rhNF-κB作用24 h。

1.3.3成骨相关基因碱性磷酸酶(ALP)染色 将滑膜成纤维细胞以适当密切接种至6孔细胞板上，常规培养过夜。弃培养液后，按照上节中的分组处理细胞。培养7 d后，先以磷酸缓冲液洗涤，再经4%多聚甲醛进行固定。固定时间为30 min。再次洗涤后，加入BCIP/NBT工作液，常温条件下避光反应30 min。洗涤后观察染色情况。

1.3.4实时PCR检测 分别参照RNA提取试剂盒和cDNA逆转录试剂盒说明书步骤提取各组细胞的总RNA并逆转录成为cDNA。取2 μL cDNA，与各1 μL上下游引物、12.5 μL的SYBR Premix Ex Taq Ⅱ和8.5 μL ddH2O混合配成总体积为25 μL的PCR扩增体系。上PCR仪，按照如下反应条件进行扩增：95 ℃ 5 min(95 ℃ 30 s；60 ℃ 30 s；72 ℃ 40 s)×40个循环、 72 ℃终延伸6 min。以U6和GAPDH为管家基因，采用 2-ΔΔCt法计算各目的基因的相对表达量。其中由上海生工生物合成的PCR引物见表1。

表1 PCR扩增引物序列

2 结果

2.1 miRNA-34a在AS来源的滑膜成纤维细胞中的表达

与正常组相比，AS对照组细胞中miRNA-34a的表达水平明显降低(P<0.05)；以TGF-β1和BMP-2作用后，AS+NC组细胞中miRNA-34a的表达水平较AS对照组明显降低(P<0.05)；与AS+NC组相比，转染miRNA-34a mimics的AS+miRNA-34a mimics组细胞中miRNA-34a的表达水平明显升高(P<0.05)，见表2。

表2 各组细胞中miRNA-34a的相对表达量比较

2.2 miRNA-34a mimics对ALP染色结果的影响

ALP染色结果显示，AS组和AS+NC组细胞的ALP活性明显强于正常组，且AS+NC组强于AS组；但是，AS+miRNA-34a mimics组的ALP活性明显低于AS+NC组。

2.3 miRNA-34a mimics对滑膜成纤维细胞成骨相关基因ALP、OCN和Runx2 mRNA表达的影响

AS组细胞中ALP、OCN和Runx2 mRNA的表达水平较正常组明显升高，而显著低于AS+NC组(P<0.05)；与AS+NC组相比，AS+miRNA-34a mimics组细胞中ALP、OCN和Runx2表达明显降低(P<0.05)，见表3。

表3 各组细胞中ALP、OCN和Runx2 mRNA的相对表达量比较

2.4 miRNA-34a mimics对滑膜成纤维细胞中Notch信号通路的影响

TGF-β1和BMP-2处理后的AS+NC组细胞中Notch信号通路的Notch1受体及其下游靶基因Hes1 mRNA的表达水平较正常组和AS组明显升高(P<0.05)；与AS+NC组相比，AS+miRNA-34a mimics组细胞中Notch1和Hes1 mRNA的表达水平明显降低(P<0.05)，见表4。

表4 各组细胞中Notch1和Hes1 mRNA相对表达量的比较

2.5 激活Notch信号通路对miRNA-34a mimics抑制滑膜成纤维细胞成骨分化的影响

与AS+NC组相比，给予miRNA-34a mimics后，韧带成纤维细胞中ALP、OPN和Runx2 mRNA明显降低；而给予Notch信号通路激动剂rhNF-κB作用后，miRNA-34a mimics对ALP、OPN和Runx2 mRNA表达的抑制作用减弱，见表5。

表5 各组细胞中ALP、OPN和Runx2 mRNA的相对表达量比较

3 讨论

AS的发病率逐年上升且已严重影响患者生活质量，越来越多的研究证实miRNAs在AS成骨分化过程中异常表达，可通过多种途径调控成纤维细胞向成骨细胞分化，进而参与AS的发生、发展过程[7-10]。

miRNA-34a属于miRNA-34家族成员，定位于1p36染色体上，在多种组织或细胞中异常表达，在骨形成和成骨细胞分化过程中发挥重要作用[11-13]。miRNA-34a可抑制人牙周膜细胞成骨细胞分化[14]。TGF-β1和BMP-2是具有促成骨分化作用的两种细胞因子，与AS病理性成骨关系密切[15-17]。本研究通过TGF-β1和BMP-2联合作用后miRNA-34a在AS来源的滑膜成纤维细胞中表达降低，提示miRNA-34a可能在滑膜成纤维细胞向成骨分化的过程中发挥着重要作用。ALP是成熟成骨细胞的标志性酶，OCN和Runx2是成骨分化的标志蛋白，三者的表达水平是反映成骨能力的主要指标[17-19]。Notch信号通路是一条十分保守的信号通路，Notch1是Notch受体之一，Hes1是其下游最为典型的靶基因，参与调控细胞的增殖和分化等过程，在骨形成和骨重建等过程中发挥着重要作用[20]。本研究结果显示，上调miRNA-34a表达可降低TGF-β1和BMP-2诱导的细胞中成骨相关基因ALP、OCN和Runx2 mRNA以及Notch信号通路相关基因Notch1、Hes1 mRNA的表达，提示miRNA-34a过表达可抑制AS滑膜成纤维细胞成骨分化和Notch信号通路的活性。给予Notch信号通路激活剂rhNF-κB作用后，miRNA-34a mimics对滑膜成纤维细胞成骨分化的抑制作用减弱，提示miRNA-34a可通过调控Notch信号通路抑制AS滑膜成纤维细胞向成骨细胞分化。

总之，miRNA-34a在AS滑膜成纤维细胞中低表达，上调其表达可通过调控Notch信号通路抑制AS滑膜成纤维细胞成骨分化，这一结果丰富了AS滑膜成纤维细胞成骨分化的分子机制，也为改善和治疗AS提供了新的线索和依据。