樱桃查尔酮合成酶獵pCHS2基因的克隆及序列分析

李孝绒 乔光 姜昱雯

摘 要：查尔酮合成酶基因是类黄酮生物合成的关键基因，本文通過巢氏PCR，从‘玛瑙红樱桃的根系组织中克隆获得一个1176 bp的查尔酮合成酶基因的cDNA序列，编码391个氨基酸，命名为CpCHS2 （基因登录号：MT112906）。该基因编码的蛋白分子量为42.68 kD，等电点为5.76，属疏水性蛋白且不具有跨膜区，主要定位在细胞质中，二级结构中α-螺旋、β-折叠为蛋白质最大量的结构原件。系统进化树分析表明，CpCHS2和同属蔷薇科的红叶李及碧桃的亲缘关系最近，并在进化上高度保守。

关键词：樱桃;CpCHS2;基因克隆;生物信息学分析

中图分类号：S662.5

文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2021）03-0001-06

国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2021.03.001

Cloning and Sequence Analysis of CpCHS2 Gene in Cerasus Pseudocerasus

LI Xiaorong，QIAO Guang*，JIANG Yuwen

（College of Life Science，Guizhou University/Institute of Agro-bioengineering/Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region Ministry of Education，Guiyang，Guizhou 550025，China）

Abstract：

Chalcone synthetase gene is the key gene for flavonoid biosynthesis.In this paper，a full-length cDNA of the CHS gene was obtained by Nested PCR from the root tissue of Cerasus pseudocerasus ‘Manaohong，whose complete cDNA was 1，176 bp，encoding 319 amino acids，and being designated as CpCHS2 （Gene accession number is MT112906）.The protein encoded by the gene has a molecular weight of 42.68 kD and an isoelectric point of 5.76.It was a hydrophobic protein and did not have a transmembrane region，which was mainly located in the cytoplasm.In the secondary structure，α -helix and β -sheet were the largest structural elements of the protein.The phylogenetic tree analysis showed that the CpCHS2 and Prunus cerasifera and Amygdalus persica of the same genus Rosaceae were closely related and highly conserved in evolution.

Keywords：

Cerasus pseudocerasus;CpCHS2;gene cloning;bioinformatic analysis

类黄酮是一类具有强烈生物活性的多酚类次生代谢产物，它广泛存在于植物中，除影响植物的生长发育，还在与环境相互作用方面起非常重要的作用[1- 2]。类黄酮可以构成部分植物防御体系，通过提高过氧化物酶的活力、减少丙二醛含量来消除和减轻逆境引起的活性氧伤害，还可以通过增加脱落酸间接增强植物的抗性[3]。柑橘类黄酮可显著改善植物对病虫害的抗性，提高柑橘抵抗逆境胁迫的能力[4- 5]。宁国贵等[6]研究发现，玫瑰可通过类黄酮合成相关基因的表达促进类黄酮积累，以此响应机械损伤和氧化胁迫。可见，植物体内类黄酮在提高植物环境适应性方面至关重要。

植物类黄酮生物合成来源于苯丙烷类代谢途径，起始反应为查尔酮合成酶（chalcone synthase，CHS）催化4-香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A形成查尔酮[7- 8]。可见，CHS酶是类黄酮合成途径中重要限速酶[9]。CHS基因是一个较大的基因家族，其保守编码区由2个外显子和1个内含子构成[10]。目前，已有大量关于植物CHS基因的报道，王志彬等[11]从10个柑橘种质中克隆获得了CHS基因，发现核苷酸序列高度保守，氨基酸序列的多态性有物种特异性。梅志栋等[12]克隆了杧果CHS1基因，半定量PCR显示该基因在叶片和花中表达量较高。张丽群等[13]克隆获得了3个茶树CHS基因，其蛋白质结构高度相似，推测可能在茶树不同部位或不同生长阶段发挥类似作用。但迄今鲜见关于樱桃CHS基因的报道。

樱桃作为深受人们喜爱的春季水果，富含大量的黄酮类化合物[14]。贵州现有樱桃种植面积已达33 333.35 hm2。为改善樱桃生长土壤环境，课题组前期开展了生物炭应用研究，发现添加生物炭提高了植株的抗性，樱桃根系转录组分析发现，生物炭处理下樱桃根系大量类黄酮生物合成途相关基因差异表达，其中CHS基因显著上调表达。本研究拟克隆樱桃CHS基因并进行序列分析，为解析生物炭提高植株适应性的机理奠定基础，同时为樱桃遗传改良提供候选基因。

1 材料与方法

1.1 植物材料

供試材料为贵州省主栽品种‘玛瑙红樱桃1年生幼苗，于2019年6月取其根尖，用液氮速冻后，置于-80℃保存备用。

1.2 基因克隆

利用植物RNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）提取根系总RNA，利用反转录试剂盒PrimeScript RT Reagent Kit（TAKARA）将RNA反转录成cDNA。本研究采用巢式PCR的方法，设计两对引物，即根据转录组所得序列，通过BLAST比对，在3UTR及5UTR区设计一对引物CpCHS2-F1和CpCHS2-R1;再在其起始密码子及终止密码子区设计第二对引物CpCHS2-F2和CpCHS2-R2，引物序列见表1。具体步骤如下，第一轮CpCHS2-F1和CpCHS2-R1为引物进行PCR反应。PCR程序为94℃预变性5 min;95℃变性50s;56℃复性15 s，72℃延伸35 s，循环15个;72℃延伸5 min。作胶回收，再以胶回收产物为模板，第二轮以CpCHS2-F2和CpCHS2-R2为引物，4℃预变性5 min;95℃变性50 s;56℃退火15 s，72℃延伸35 s，循环34个;总延伸，72℃，5 min。将巢式PCR获得的大小合适的单一条带胶回收后加A尾后至PMD19载体。反应完成后转化至大肠杆菌感受态，挑取10个单克隆送测序，测序由生物工程（上海）股份有很公司完成。

1.3 氨基酸序列生物信息学分析

通过DNAMAN进行CpCHS2氨基酸序列的比对;通过ProtParam对CpCHS2的氨基酸序列的基本理化性质进行分析;利用ProtScale对CpCHS2的蛋白亲疏水性进行分析;通过TMHMM2.0则可以对蛋白的跨膜结构进行预测;通过NetPhos 2.0可对CpCHS2蛋白可能的磷酸化位点进行预测;利用SignalP-5.0对CpCHS2的信号肽进行分析;利用WoLFPSORT可预测蛋白的亚细胞定位;而利用SOPM二级结构预测方法对CpCHS2的二级结构进行了预测;最后利用Phyre2对CpCHS2蛋白三级结构进行了预测解析。利用MEGA6.0构建Neighbor-Joining tree（NJ树），Bootstrap值设置为1000。

2 结果与分析

2.1 CpCHS2基因克隆

克隆获得的樱桃CHS基因全长1176 bp（图1），编码391个氨基酸，经BLAST数据库比对后，命名为CpCHS2（Gene登录号：MT112906）。利用ProtParam对CpCHS2的基本理化性质进行分析，结果表明，该蛋白分子量为42.68 kD，等电点为5.76，其中Leu的含量最高（10.7%），其次为Ala（9.0%）;分子式为C1904H3051N507O566S18，原子总数为6046;不稳定系数为36.16，脂肪系数为94.04;估算其半衰期为在哺乳动物中为30 h，酵母中大于20 h，大肠杆菌中大于10 h，表明该蛋白较为稳定。

2.2 CpCHS2蛋白结构域与氨基酸序列比对分析

利用PFAM对CpCHS2氨基酸序列进行蛋白结构域预测，结果显示，该蛋白包括一个Chal_sti_synt_N（4-228）和一个Chal_sti_synt_C（238-388）结构域。Chal_sti_synt_N功能为查尔酮和二苯基乙烯的N端结构域，而Chal_sti_synt_C为查尔酮和二苯基乙烯的C端结构域（图2）。CpCHS2的基因及氨基酸序列如下（图3）。

利用NCBI的BLAST功能，获得了包括樱桃在内的17个植物物种的CHS2基因，并通过DNAMAN进行氨基酸序列比对。比对结果表明，CHS2蛋白序列在双子叶植物不同科属间高度保守（图4），序列相似度91%以上;进一步构建NJ树（图5），可以发现樱桃的CHS2基因与红叶李（Prunus cerasifera Ehrh.）及碧桃（Amygdalus persica L.）的CHS2基因分属同一枝，说明在进化上，樱桃和同属蔷薇科的红叶李及碧桃的亲缘关系可能更近。另外，CpCHS2和红叶李CHS2的蛋白序列相似度为99.3%，与碧桃的序列相似度为94%，系统发育树与氨基酸序列比对结果一致。

2.3 CpCHS2蛋白疏水性预及信号肽预测

蛋白疏水性预测表明（图6），CpCHS2得分最小负值为-0.322，最大正值为2.111，总平均亲水性（GRAVY）为0.866，根据负值越大，亲水性越高;正值越大，疏水性越高的标准来判断，预测该蛋白属于疏水性蛋白。

利用SignalP-5.0对CpCHS2蛋白的信号肽进行预测。结果显示，CpCHS2蛋白上没有信号肽，说明该蛋白并非入核蛋白。

2.4 CpCHS2蛋白跨膜预测

用TMHMM2.0对CpCHS2蛋白的跨膜结构进行预测，发现该蛋白并非跨膜蛋白，但在其C端有一个大约30个氨基酸的跨膜区，表明其可能会位于膜上行使功能（图7）。

2.5 CpCHS2蛋白磷酸化修饰预测及亚细胞定位预测

磷酸化和去磷酸化是细胞内信号转导的重要方式。通过 NetPhos2.0对CpCHS2蛋白可能的磷酸化修饰位点进行预测发现，包括12个丝氨酸残基（S），2个酪氨酸残基（Y）及10个苏氨酸残基（T）是潜在的磷酸化位点。

利用WoLFPSORT对CpCHS2蛋白进行亚细胞定位预测， 结果发现其最有可能定位于细胞质中，这与CHS2类黄酮合成的功能是一致的。

2.6 CpCHS2蛋白结构预测

通过SOPM二级结构预测方法对CpCHS2的二级结构进行了预测。结果表明，CpCHS2的蛋白二级结构包括41.43%的α-螺旋，11.25%的β-折叠，30.18%的随机卷曲以及17.14%的延伸链。对樱桃的CpCHS2蛋白进行了三级结构预测（图8）。结果发现CpCHS2的391个氨基酸残基中有388个残基（99%）可在已知紫花苜蓿的查尔酮合酶基因三级结构中覆盖（置信度100%），说明该三级结构基本可视为樱桃CHS2是蛋白三级结构。

3 结论与讨论

CHS基因广泛分布于植物体中，其家族成员在各物种中数量不同，如在模式植物拟南芥中仅有一个单拷贝CHS;LO等[15]对高粱的研究发现其包含7个CHS基因以及一个CHS类似基因CHS8;而最近对桑树的研究表明CHS基因有5个成员[9]。多个CHS基因在同一物种的存在确保了植物可以利用多种底物完成各种生物学功能。如在大麦中，CHS1以肉桂酰辅酶A和4-酰基辅酶A为底物合成查尔酮，而CHS2则以阿魏酰辅酶A和咖啡酰基辅酶A为底物进行合成[16]。最终，通过一系列过程合成的小分子有机物可行使诸如花色素沉积、紫外保护以及应对各种生物与非生物胁迫的功能。表达分析表明，桑树5个CHS基因成员中，CHS1与CHS2在果实中高表达，CHS4主要在根表皮、茎表皮和老叶表达，而CHS3和CHS5则在老叶中高表达[9]，说明桑树CHS基因的表达部位发生了分化，从而在不同组织中行使不同功能。

本研究克隆的樱桃CHS基因由于该基因功能的高度保守性，且其基本上整个氨基酸序列都分属两个结构域，因此其氨基酸序列也表现出了高度的保守性。且该基因与红叶李、碧桃等物种CHS基因家族中的CHS2氨基酸序列相似度在91%以上，因此将该基因命名为CpCHS2。对CpCHS2的跨膜结构域和信号肽研究预测表明，CpCHS2没有跨膜结构域也没有信号肽，说明该蛋白并非分泌蛋白，其主要在细胞内发挥合成酶功能，这与对龙胆木CHS蛋白的预测结果一致[17]。而对CpCHS2的系统发育分析则表明，樱桃CHS2和同为蔷薇科植物的红叶李及碧桃在同一进化枝，说明这三者的亲缘关系要更近。

CHS基因与植物病菌胁迫响应密切相关，如高粱CHS8基因在真菌感染时可参与防御相关类黄酮合成[15];NAGY等[18]发现挪威云杉被长喙壳属真菌感染后CHS蛋白水平显著提高;大麦的CHS2基因在小麦白粉病感染后表达量显著提高[16]。早在1993年，HARRISON等[19]即发现苜蓿被地表球囊菌感染后CHS基因表达量在菌根处会显著提升，FERRER等[21]在1999年对紫花苜蓿的CHS蛋白三级结构进行了解析。本研究获得的CpCHS2基因，在转录组中显著上调，经过蛋白三级结构预测发现其与苜蓿CHS蛋白有85%的空间结构相似度，由此我们推测该基因在响应樱桃病菌感染方面很有可能行使着重要的功能，这将是我们未来的工作内容。

参 考 文 献：

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