不同农药及培养基质对木耳菜富硒能力的影响探究

许为义，曹思宇，陈菡雯，孙 晨，刘 莉，伍 鑫，王玉明

(合肥工业大学 资源与环境工程学院，安徽 合肥 230009)

0 引言

硒对人体健康和生理代谢起到至关重要的调节作用[1].Larry C.Clark研究发现，每日补充200 μg硒可将癌症发病率降低37%、死亡率降低50%.美国食品药品监管局(FDA)将硒称为抑癌剂[2-3].《中国居民膳食营养素参考摄入量》推荐成年人日均摄入硒元素60 μg，但实际中国居民日均摄入量仅44 μg，低于最低参照摄入量(50 μg·d-1)[4]，这潜在增加了国民患心血管、癌症等疾病的风险.

自然食物有机硒是居民摄入有效硒最便捷和安全途径，为践行“健康中国”的国策使命，研究者们深入开展植物富硒性能、机制及影响因素等研究工作，积极研发多种安全健康的优质富硒农产品，包括富硒茶、富硒大米、富硒辣椒等农作物.相关研究表明，自然植物富硒量与植物品种、土壤母质自然硒含量及理化特性有关，Lin[5]等人发现当土壤硒浓度为25 mg·kg-1时，甜菜富硒量达到峰值；王锐[6]等人证实玉米富硒土壤阈值是0.3 mg·kg-1，水稻在土壤pH≤7.5时富硒土壤阈值是0.3 mg·kg-1，而在pH>7.5时以0.4 mg·kg-1为富硒土壤阈值.

然而，农作物耕种最常施用的农药，其对植物富硒能力的影响研究报道甚少.本文选择广泛分布于南亚、东南亚、东亚的富硒能力较好且富含多种维生素和钙、铁等营养元素，并具有利便、清热、解毒功效的药食同源蔬菜木耳菜为试验品种，试图探索农林业中广泛使用的“绿色除草剂”[7]草甘膦和拟除虫菊酯类杀虫剂氯氰菊酯[8]，对基于不同基质(火山岩和土壤基质)上生长的木耳菜富硒能力的影响，以便科学地指导生产实践.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 材料和试剂

实验土壤取自于皖南宣城市(N30°54′19.66″，E118°42′46.69″)宣州区的黄棕壤，其有机质含量为2.13%，pH值为5.00[9-10]，土壤肥力较高，适于种植粮食和经济作物[15].实验区域属于亚热带湿润季风气候，水热条件好，地质调查揭示地区富硒土壤(0.4 mg·kg-1)占比约43%，土壤理化性质类似于湖北恩施.

实验培养基质设计两种不同性质基质：土壤基质和火山岩基质，其中土壤基质配比构成(分两个阶段添加农药)和火山岩基质配比构成见表1.

表1 土壤培养基农药施加情况

表2 火山岩培养基农药施加情况

1.1.2 仪器和试剂

实验用主要仪器：电子天平(JA2003B，上海越平)；pH计(PHS-3C上海雷磁)；数显恒温水浴锅(HH-2，金坛杰瑞尔)；去离子水系统(752N，上海精科)；植物破碎机(FSH-2A，VRera，南京)；紫外分光光度计(752 N，上海精科)；土壤培养皿(规格：185×180×145 mm，北京仁创科技集团有限公司)；火山岩培养皿(规格：185×190×200 mm).

酵母硒(有效硒含量为3 000 ppm，武汉远城科技发展有限公司)；草甘膦(总有效成分为93%，重庆丰化科技有限公司)；氯氰菊酯(含4.5%乳油，河南省金旺生化有限公司)；邻苯二胺(AR100，天津市光复科技发展有限公司)；甲苯(AR，天津市光复科技发展有限公司)；EDTA-2Na(AR100，天津市光复科技发展有限公司)；浓硝酸(GR，天津市光复科技发展有限公司)；盐酸(GR，天津市光复科技发展有限公司)；高氯酸(GR，天津市光复科技发展有限公司)；氨水(AR，天津市光复科技发展有限公司).

1.1 实验设计

本实验分两阶段进行.第一阶段在不同的基质中，探究同浓度梯度下草甘膦的富硒能力；第二阶段在相同培养基(土壤)中，探究相同浓度梯度的农药草甘膦和杀虫剂氯氰菊酯对木耳菜富硒能力的影响.

1.1.1 第一阶段

该阶段仅于出芽后24 d时采样一次，设置1个空白对照组和5个实验组(土壤组A-F与a-f为实验条件完全相同的两组，在第一阶段取a-f结果，A-F仅用于对比检验).以土壤硒均值5.5 mg·kg-1为标准，且在保证两种培养基内单位体积的硒含量相等的条件下，每个培养基投加有机硒含量为3 000 ppm的酵母硒1.962 g.根据该款草甘膦的推荐使用浓度82～118 g/亩求得培养基最佳使用量，并以最适浓度为基准按25%浓度梯度增加和递减分别向两种培养基进行投加(表1～2).需要注意的是，由于草甘膦可能抑制种子的萌发，故需将培养基质放置3 d后再加入木耳菜种子，为提高幼苗成活率，本实验在种子出芽后第4 d和第10 d添加生根剂、第7 d和第14 d添加植物营养液，添加量均为最适用量.

1.1.2 第二阶段

第二阶段实验组与空白组设置与第一阶段相同，在第一阶段采样完成后，于a-f、A-F的基础上分别继续添加草甘膦和氯氰菊酯.有研究表明，草甘膦在土壤中的半衰期为1～174 d(一般取60 d)[11]，且在含水量为60%的酸性土壤中16 d即可降解80%以上[12].因此，可认为首次添加的草甘膦不会对本次施加的草甘膦或氯氰菊酯造成影响.根据该款氯氰菊酯的推荐使用浓度40 mL/亩求得培养基最佳使用量，并以最适浓度为基准按25%浓度梯度增加和递减投加至土壤培养基.本实验阶段自出芽后第27 d起采样，采样间隔为7 d，共采集10次.

1.2 样品采集与处理

1.2.1 培养基的制备

土壤培养基随机取自研究区内表层土，采样深度为10 cm，去除土壤表面杂草、土壤中残留根茎，经日晒、风干、除杂、碾碎、混合后，以每个土壤培养皿1 070 g分样.

火山岩培养基采用吸水性为65%、pH为5～7的火山岩，以每个火山岩培养皿830 g分样，上层覆等量薄土.

1.2.2 样品的自然培育

本实验中木耳菜播种至培养基后，均于室外自然条件下培育，并配合人工灌溉.灌溉采用笔者自主研制的自动灌溉装置，每日于晨间8时、午间12时及晚间6时各灌溉一次，每次持续1 min(水量约60～70 ml).

1.2.3 样品采集

初次采样时间为出芽后24 d，此后另分阶段于出芽后第27、34、41、48、55、62、69、76、83和90 d采样.为避免由于酵母硒添加时分布不均、木耳菜扎根浅等而导致吸附不均，本研究采用网格法采样，即将培养基十字划分为4个大小相等的部分，每次采样时从每隔中

随机采取2-3株样品，最后将采集的所用样品混合均匀.

1.2.4 样品预处理

用去离子水清洗样品后，将样品研磨成匀浆，在千分之一天平上称取1.5 g置于100 mL锥形瓶内.为防止杂质干扰、富集样品中的硒、并将硒转化为可被测定的形态，需对采集的样品进行消解，本实验采用HNO3-HClO4湿式消解法.此外，在酵母硒及其他药剂施加完全相同的条件下，用去离子水代替农药，作为空白对照.

用去离子水清洗样品后，将样品研磨成匀浆，在千分之一天平上称取1.5 g置于100 mL锥形瓶内.为防止有物质对测定造成干扰、并将硒转化为可被测定的形态，同时防止硒的含量低于仪器的检测限，需对采集的样品进行消解，本实验采用HNO3-HClO4湿式消解法.此外，在酵母硒及其他药剂施加完全相同的条件下，用去离子水代替农药，作为空白对照.

1.3 样品测定

本实验采用紫外分光光度法测定植物体内的硒含量，该方法具有灵敏度高、设备简单易操作等优势[13].

2 结果与分析

2.1 不同基质对木耳菜富硒能力的影响

由于火山岩基质的样品仅在出芽后24 d取样一次，为控制取样时间相同，本节取土壤基质初次采样的样品，将二者日均富硒量进行对比(图1).由图，a、g均为空白对照，检测结果作为木耳菜基础富硒值.随施加草甘膦浓度的升高，土壤与火山岩基质总体均表现为促进木耳菜富硒，但二者均存在最适富硒浓度，即在草甘膦施加达到最适浓度时促进作用最强.火山岩基质的最适富硒浓度为0.003 6 g/培养基，此时日均富硒量0.720 mg·kg-1；土壤基质的最适富硒浓度为0.002 4 g/培养基，对应日均富硒量0.463 mg·kg-1.通过观察柱状图的变化趋势，可以得出火山岩基质中草甘膦的最适富硒浓度较土壤基质更高，且峰值富硒量也更高.这可能与火山岩的天然的蜂窝多孔结构及表面正电荷相关[14]，火山岩的该特性可以促进木耳菜对药剂肥料的吸收、减少流失，从而提高养分固持.火山岩的酸性较黄棕壤弱，可增加硒元素由固态溶解为有机态[15]，提高硒的有效性.

2.2 草甘膦与氯氰菊酯对植物富硒能力的影响

在第二阶段实验条件下，草甘膦与氯氰菊酯对木耳菜富硒表现出不同的促进作用，但任何农药施加浓度过高时，均会对植物富硒产生抑制作用，且该抑制作用的强弱与施加浓度大小存在显著正相关关系.这一方面是由于高浓度农药产生药害，影响植物的正常生长，甚至导致植物死亡；另一方面高浓度的农药也对土著微生物表现出抑制作用，改变土壤生物群落结构，从而破坏土壤微生态[16].本研究中氯氰菊酯即为典型，其在高浓度下对木耳菜富硒能力的抑制较草甘膦更强.鉴于此，草甘膦与氯氰菊酯均存在促进木耳菜富硒的最适施加浓度.由图2(c)，草甘膦最适富硒浓度出现在施加量为0.002 9 g/培养基(c组)，最佳促进区段为出芽后34～62 d，对应的最大富硒量为1.007 mg/(kg·d-1)；氯氰菊酯的最适富硒浓度则出现在施加量为0.001 8 g/培养基(d组)时，其最佳促进区段为出芽后41～62 d，对应的最大富硒量为0.902 mg/(kg·d-1)(图2(d)).另外，两种农药对木耳菜富硒的促进作用均随生长时间的推移先增强再减弱，本研究结果表明，一般情况下施加草甘膦较氯氰菊酯能更快表现出对木耳菜富硒的最佳促进，且草甘膦的促进作用表现相对氯氰菊酯强，这可能与草甘膦的高分解代谢速率和分解产物低毒性、易被生物利用密切相关[17-18].

图2 不同浓度草甘膦和氯氰菊酯对木耳菜富硒的影响对比(图(a)-(f)分别对应氯氰菊酯A-F组及草甘膦a-f组)

2.3 草甘膦与氯氰菊酯对木耳菜富硒的影响随时间的变化

为验证2.2中所述两种农药对木耳菜富硒的促进作用随生长时间的变化规律，本节在施加最适富硒浓度的草甘膦(c组0.002 9 g/培养基)和氯氰菊酯(d组0.001 8 g/培养基)条件下的木耳菜日均富硒量实验数据与生长天数建立回归模型(图3).

图3 木耳菜富硒能力随时间变化的线性拟合(图(a1)、(a2)分别对应草甘膦c组出芽后27～55 d和56～90 d；图(b1)、(b2)分别对应氯氰菊酯D组出芽后27-55 d和56-90 d)

木耳菜出芽后55 d内，草甘膦与氯氰菊酯对木耳菜富硒能力的促进均与生长时间存在正相关关系，且草甘膦的促进作用比氯氰菊酯更显著(R2=0.941 4>0.713 8).出芽55 d后，二者的促进作用开始减弱，其对富硒能力的促进与生长时间成负相关，甚至出现抑制现象，草甘膦的抑制效果同样更显著(R2=0.941 8>0.843 9).

施加草甘膦的木耳菜第二阶段较第一阶段促进富硒作用减弱是受气温、湿度及其生长阶段等影响；氯氰菊酯表现出的相关性相对较弱正是由于2.2中发现施加草甘膦与氯氰菊酯达到最大富硒量存在时间差，则此时施加氯氰菊酯对木耳菜富硒的促进作用由升至降的转折点应比草甘膦的转折点更晚，而本实验中并未探讨其准确时间节点.因此，本节中所述显著性大小比较不能直接反映两种农药在最适浓度时的促进效果.

3 讨论

根据笔者的前期实验，可以发现：(1)火山岩由于其特殊的理化特性和内部结构表现出比土壤基质更优的促进木耳菜富硒能力，但其所需施加的草甘膦浓度也稍大于土壤基质，此时应根据不同种植情形考虑成本问题；(2)草甘膦与氯氰菊酯在一定浓度范围内均对木耳菜富硒有促进作用，但浓度过高时促进作用会减弱，甚至表现为抑制，草甘膦最适富硒浓度为0.002 9 g/培养基，对应最大富硒量为1.007 mg/(kg·d-1)；氯氰菊酯的最适富硒浓度为0.001 8 g/培养基，对应的最大富硒量为0.902 mg/(kg·d-1)；(3)草甘膦和氯氰菊酯在最适富硒浓度下，其促进作用均随出芽天数的增加表现为先增加再减弱，施加草甘膦的达到促进效果的时间总体上少于氯氰菊酯.在充分考虑不同地域培养基质理化性质、作物种类及施加药剂特异性的条件下，以上结论可以为富硒作物的农业生产提供借鉴.

在本研究的基础上，存在大量值得思考的问题，如有机态硒是否会进一步增强草甘膦对木耳菜转化富集硒的促进作用？农药对作物富硒能力影响的分子生物学机制是什么？目前，大量研究表明，植物多吸收水溶性硒(包括硒酸盐、亚硒酸盐和有机硒)，其运输机制主要有三种[19]：(1)硒酸盐的吸收主要依靠高亲和力的硫酸转运子SULTR1；1和SULTR1；2完成；(2)利用ATP硫酸化酶(ATPS)、硒代半胱氨酸甲基转移酶(SMT)、5′-磷硫酸腺苷还原酶(APR)将硒酸盐、亚硒酸盐转化为有机硒吸收；(3)5′-磷酸硒腺苷(APSe)通过APR调控完成硒酸盐同化.而草甘膦作用于非靶标植物时首先会与植物根系直接接触，导致草甘膦在其根部大量富集，同时被代谢为氨甲基膦酸(AMPA)，根中的草甘膦和AMPA会通过木质部或韧皮部运输到可食用茎和叶中[20].另外，姚国君[21]以油菜、黄瓜、番茄、甘蓝和辣椒为植物样本，发现氯氰菊酯在非靶标生物中也存在降解途径，且在辣椒中表现最为显著.在上述的代谢过程中，草甘膦和氯氰菊酯是否会影响到植物转运硒元素时所涉及到转运蛋白、关键酶、甚至调控某些基因的表达等科学问题[22]，随着“组学”的概念兴起，高通量测序、靶向测序、荧光定量PCR检测、蛋白质印迹和全转录组测序等方法逐渐成熟，也将会得到新的突破.