基于荧光免疫分析技术的食品中污染物检测方法研究进展

杜 戎，虞睿宁，袁 好，张倩瑶，郭亚辉, ，姚卫蓉，钱 和

（1.江南大学食品学院，江苏无锡 214122；2.桐庐县检验检测中心，浙江杭州 311500）

食品安全是世界各国共同关注的重大公共卫生问题，关乎人民生命健康、经济发展和社会稳定。受原材料、加工技术以及生态环境的影响，食品污染物残留问题时常发生，成为威胁人类健康的一大隐患。常见的食品污染物包括农药残留、兽药残留、真菌毒素、有害微生物等。传统的食品污染物检测技术以仪器分析方法为主，如电化学法、光谱法、色谱法、质谱法等[1−2]，液相色谱-串联质谱法[3−4]、气相色谱-质谱法[5−6]等联用方法在食品化学污染物的多重定量检测中取得了重要进展。仪器分析方法测定结果准确、抗干扰能力强、稳定性可靠，但也往往存在操作复杂、检测时间长、检测成本高、设备不便携带等不足，难以满足快速、高效、廉价、便捷的现场检测和批量筛选需求。免疫分析技术利用抗体与相应抗原或半抗原之间自发的免疫学反应实现对各类食品污染物的快速、准确、简便和特异性检测，弥补了传统食品污染物检测技术的缺陷。常见的免疫分析技术有胶体金免疫层析技术、荧光免疫分析技术、放射免疫分析技术、酶联免疫吸附技术和化学发光免疫分析技术等。其中，荧光免疫分析技术（fluorescence immunoassay，FIA）以荧光物质标记抗体（或抗原），基于抗原-抗体反应，利用待测物质在反应体系中特异结合位点荧光的强弱，定性或定量分析以得出检测结果，近年来凭借较高的灵敏度在生物[7]、医药[8]、环境[9]等领域得到广泛应用，在食品污染物检测领域发展尤为迅速。

自20世纪40年代发展至今，荧光免疫分析技术正在走向成熟，标记材料日趋丰富。Coons等于1941年首次采用荧光素标记抗体而成功进行了抗原定位，荧光免疫分析技术由此产生[10]。基于荧光分子具有易实现多次激发的特点，Ambrose、Mathies和Nguyen等实现了荧光单分子检测[11]；1983年，Soini和Kojola等使用镧系元素作为标记物，建立了时间分辨荧光免疫分析技术，有效排除了样品中的非特异荧光干扰，提高了荧光免疫分析技术的灵敏度[11]。随着量子点制备技术不断提高，其作为标记材料用于生物学研究逐渐成为可能，陆续有研究者发表以量子点作为生物探针的论文，将其作为荧光标记应用于检测领域，掀起量子点的研究热潮。

随着材料科学领域的不断进步，上转换发光纳米材料、荧光蛋白和磁性荧光纳米材料等新型材料也逐渐走入研究人员的视线。这些新材料、新技术的出现，推动了荧光免疫分析技术更好地融合荧光材料、免疫学和仪器分析技术的发展成果，不仅灵敏度高、特异性好，还有实现检测自动化、智能化的潜力。本文综述了荧光免疫分析技术中的3类常用荧光标记材料和3类新型荧光标记材料，比较了各类荧光材料的光学特性和分析性能，阐述了荧光免疫分析技术在食品污染物检测中的研究进展并重点介绍了多重定量检测、荧光共振能量转移及比率荧光分析等热门技术在食品污染物检测中的应用，以期帮助读者更全面地了解荧光免疫分析技术中的发展现状，更深入地认识荧光免疫分析技术在食品污染物检测领域的应用价值，为新型荧光免疫分析技术的研发和食品污染物检测方法的构建提供一定的理论指导依据。

1 常用荧光标记材料

1.1 普通荧光染料微球

荧光素是一类能产生明显荧光的有机染料，是最早应用于免疫分析技术的荧光物质。这类材料价格低廉，在荧光免疫分析技术中应用非常广泛。目前，FIA中使用的荧光素主要有两类：一类可被紫外光直接激发，如异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明等；另一类则本身没有荧光效应，需要经酶催化才能形成强荧光物质，如4-甲基伞酮-β-D、4-甲基伞酮磷酸盐和对羟基苯乙酸等[10]。任姿静等[12]以异硫氰酸荧光素为标记物，建立了一种高灵敏、高选择性、低成本检测赭曲霉毒素的新型免疫荧光分析法，在最佳实验条件下荧光强度的变化值（ΔF）与赭曲霉毒素浓度的对数在1 nmol/L～100μmol/L范围内呈良好的线性关系，检出限为0.35 nmol/L，这在食品安全领域中具有潜在应用价值。

然而，大部分荧光素稳定性差，光照时易发生分解和光漂白，低浓度下信号微弱，高浓度下易淬灭，影响了分析结果的准确性和可靠性[13]。通过化学偶联法、包封法、物理吸附法、共聚法和自组装等方法[14]，将荧光素吸附或包埋于载体材料中制成纳米级或微米级的荧光微球（fluorescent microspheres，FMs），能有效改善其光学性质和分析性能。荧光微球采用核壳结构，外层载体材料主要有单体材料（如聚苯乙烯、SiO2、ZnS等）和聚合物材料（如聚乳酸微球、淀粉微球、壳聚糖微球等）[15]。荧光微球比表面积大、吸附性强、凝集作用大、表面反应能力强，与普通荧光素相比形态结构更稳定、发光效率更高，具有良好的单分散性、重复性和生物相容性，尤其适用于微生物、蛋白质及生物小分子的检测分析[14−15]。程敏等[16]采用荧光微球纳米粒子作为免疫标记物，偶联黄曲霉毒素B1单克隆抗体制备纳米探针，建立了针对决明子基质中黄曲霉毒素B1的荧光微球免疫层析定量检测方法。该方法的线性范围为0.1～2.0 ng/mL，灵敏度为0.034 ng/mL，特异性良好，检测结果与高效液相色谱法一致，可满足对现场大批量决明子样本快速定量筛查的需求。

近5年来，以荧光素为标记材料的食品污染物检测方法研究热度并不高，而荧光微球的核壳式结构作为一种稳定、高效的结构被多次应用于量子点、时间分辨荧光材料中制成量子点微球、时间分辨荧光微球。同时，多色荧光微球还为食品污染物多组分分析方法开辟了新思路。Zhang等[17]首次研制了一种以双色荧光微球为标记物的多重免疫分析方法，采用该方法对鱼类样品中微囊藻毒素-LR和冈田酸进行检测，检测限分别为0.074和2.42μg/kg，回收率达到89%以上。检测能在20 min内完成，结果与高效液相色谱-串联质谱法差异不大，为多种食品污染物的现场检测提供了高效、可靠、灵敏的方法。

1.2 量子点

量子点（quantum dots，QDs）是一种纳米级别的半导体材料，粒子半径小于或接近激子玻尔半径，包括由Ⅰ～Ⅵ族、Ⅲ～Ⅴ族、Ⅳ～Ⅵ族、Ⅴ～Ⅵ族元素组成的纳米晶，以及金簇、银簇、硅点、碳点、复合荧光纳米粒子等[18]。单核型的QDs存在表面缺陷，通常采用Cd Se/CdS、CdSe/ZnS、CdSe/ZnSe、CdS/ZnS、CdS/HgS、CdSe/CdS/ZnS、Cd Te/ZnS等核壳体系，改善量子点的稳定性和产率[19]。

量子点具有强而稳定的荧光信号，对化学物质和生理代谢降解的抵抗力很强，有良好的光漂白能力。其颜色也丰富多样，通过调节量子点的粒径尺寸就能得到不同的荧光颜色，用于多色标记。在实际应用中，为使量子点具有更好的生物相容性，研究者们通常进行表面修饰，既有利于QDs与抗原或抗体的偶联，也能降低QDs的毒性[20]。量子点因其独特的光学性质常被用作新型的荧光标记材料，取代原有的荧光染料分子，与荧光免疫分析技术相结合，应用于生物体内病菌和毒素的检测[21]。

量子点的多色性常用于同一体系中多种食品污染物的同时检测，以缩短检测时间，提高检测效率。Duan等[22]建立了一种用3个试验系和1个控制系同时对玉米样品中玉米烯酮（ZEN）、赭曲霉毒素A（OTA）和伏马菌素B1（FB1）进行定性检测的多重免疫色谱法（mICA）。将CdSe/ZnS量子点封装合成3个具有黄色、橙色和红色发光特性的量子点纳米线，与抗OTA单克隆抗体、抗FB1单克隆抗体和抗ZEN单克隆抗体偶联，分别用于OTA、FB1和ZEN的检测，最终得到OTA、FB1和ZEN的检测限分别达到5、20和10 ng/mL，可用于农产品中的多种霉菌毒素的检测。廖芸[23]基于荧光量子点，建立了三唑磷、对硫磷和毒死蜱农药多残留荧光免疫分析方法。

多目标物定量检测时常常会受到目标物浓度的干扰，以传统的抗鼠IgG 抗体喷涂试纸条C线，T/C比值法进行试纸条多重定量的准确度和稳定性差，无法满足实际定量检测的需求。邵艳娜[24]构建的基于量子点荧光微球（QBs）免疫层析法多重定量检测黄曲霉毒素B1、伏马菌素B1和赭曲霉毒素A的新方法解决了这个问题，原理如图1所示。通过引入链霉亲和素-生物素系统作为一个独立的控制线（control line，C线），消除不同批次试纸条，温湿度、反应时间，甚至是加样误差等不可控因素对试纸条免疫反应的影响，操作也更简单，检测结果准确可靠。

图1 量子点荧光微球多重免疫层析试纸条定量检测AFB1、FB1和OTA 的原理图[24]Fig.1 Schematic diagram of quantitative detection of AFB1,FB1 and OTA by multiple immunochromatographic strips with quantum dot fluorescent microspheres[24]

传统的竞争性酶联免疫分析法（cFELISA）是用辣根过氧化物酶（HRP）作为竞争抗原的载体，但其灵敏度往往达不到快速检测的标准。新型信号传感器的应用虽然能有效提高灵敏度，但在实际工业化操作过程中实施起来还存在很多困难。而Lu等[25]用伏马菌素B1标记的过氧化氢酶（CAT）替代HRP，通过降低竞争抗原与抗体的结合亲和力，同时调节酶与抗原的偶联比率，有效增强荧光信号强度，建立了一种高效灵敏检测伏马菌素B1的竞争荧光酶联免疫吸附法，比传统的基于HRP的酶联免疫吸附试验的结果低15倍。Zhou等[26]基于同样方法，用150 nm量子点微珠作为竞争抗原载体，实现巴氏杀菌乳、酸奶和奶粉中黄曲霉毒素M1的超灵敏检测。

近年来，量子点也常被用于荧光共振能量转移技术（fluorescence resonance energy transfer，FRET）以及比率荧光分析法中。徐威[27]将绿色量子点和红色量子点分别与抗黄曲霉毒素B1（AFB1）偶联，利用抗原抗体之间的特异性反应以及FRET体系，建立了AFB1均相竞争免疫新方法，成功应用于AFB1的定量检测。Willard等[28]将生物素化的牛血清白蛋白（bBSA）与四甲基罗丹明标记的链霉亲和素特异性结合，构建基于量子点的荧光共振能量转移体系，使得四甲基罗丹明的荧光强度大大增强，提高了检测的灵敏度。基于量子点的FRET体系常用于比率荧光探针的制备过程。He等[29]将CQDs作为能量供体，金纳米团簇（AuNCs）作为受体，制作了一种新型的基于FRET体系的比率荧光传感器用于检测多巴胺含量，其检测结果肉眼可见、准确度高，同时低毒性的供体和受体有利于其在生物分析领域的应用。

1.3 时间分辨荧光材料

时间分辨荧光材料一般是指镧系稀土元素，包括铕（Eu）、铽（Tb）、钐（Sm）和镝（Dy）等，常用于时间分辨荧光免疫分析法（time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）。镧系稀土元素荧光寿命较普通的荧光标记物寿命长，且Stokes位移较大，待短寿命背景荧光消失后，测定长寿命的镧系稀土元素螯合物荧光（如图2）[30]，可避免背景荧光的干扰，达到定量分析的目的。

图2 时间分辨荧光测定原理[31]Fig.2 Principle of time resolved fluorescent materials[31]

由于实现了特异性荧光与非特异性荧光分离，发射荧光与激发荧光分离，时间分辨荧光材料具有很高的特异性和灵敏度。较强的荧光性和稳定的螯合物也使得时间分辨荧光材料的线性范围更宽，重复性更好。同时，时间分辨荧光材料还具有高稳定性和多标记等优势[32]。因此，这种材料已广泛应用于生命科学、医学、生物学、化学等各领域。但由于镧系稀土元素在标记过程中的繁琐操作以及螯合剂的使用，时间分辨荧光材料的处理过程相比于普通荧光材料更为复杂。

目前最常见的抗原或抗体标记物是铕和钐，且广泛应用于多组分检测或多标记检测中。而将铽和镝作为标记物的检测方法相对较少，目前处于研究阶段。朱建国[33]将抗玉米赤霉烯酮毒素（ZEA）、抗黄曲霉毒素B1（AFB1）和抗百菌清（CTN）3种高特异性单克隆抗体与铕微球偶联制备免疫荧光探针，通过优化抗体标记浓度、荧光探针用量、免疫试剂用量、免疫层析条件等，建立了一种能同时检测真菌毒素和农药残留的时间分辨免疫荧光层析方法，ZEA、AFB1和CTN的检出限分别为0.043、0.011和0.084 μg/kg，在做到省时省试剂的同时，保证了准确度和稳定性，具有良好的市场应用价值。多标记检测已成为现有检测技术发展的一种趋势，可用于多种分子的筛查实验和贵重样品的检测。利用不同镧系金属离子荧光波长和荧光衰变时间的差异，通过TRFIA法进行测量达到目的。双标记 TRFIA具有同时检测两种物质且无互相干扰的特点，省时、省力和省试剂，在兽药和农药残留中得到广泛应用，最常用的两对镧系金属离子分别是Eu3+和Sm3+，Eu3+和Tb3+。Bacigalupo等[34]以铕（Eu3+）和铽（Tb3+）为荧光标记物，建立了一种检测氢化可的松和盐酸克伦特罗的双标记时间分辨荧光免疫分析法，并成功应用于食品检测中。Sheng等[35]以铕（Eu3+）和钐（Sm3+）为荧光标记物，检测食品中的噻虫胺和烯唑醇，在优化的检测条件下，噻虫胺的最大半抑制浓度（IC50）和检出限（LOD，IC10）分别为5.08和0.021μg/L，烯唑醇为13.14和0.029μg/L，具有较高的灵敏度。

时间分辨荧光材料具有灵敏度高、稳定性好、检测范围广等优势。其中，灵敏度高最为显著。许多研究表明，时间分辨荧光材料检测的灵敏度和准确度一般高于酶联免疫吸附法（ELISA）和传统的液相色谱法。Zhou等[36]采用间接TRFIA法定量检测恩诺沙星，发现其灵敏度显著高于酶联免疫吸附法、液相色谱法。时间分辨荧光材料通常依托镧系金属螯合物进行检测，但螯合物的发光信号很容易受到各种猝灭剂的影响，其使用会受到各种限制，灵敏度也会随之降低。为克服这一缺点，通常用纳米颗粒包裹镧系金属螯合物，避免外界干扰，同时采用生物素－链霉亲和素放大系统，可大大提高灵敏度，原理如图3所示。Tang等[37]在检测炭疽病毒保护性抗原（PA）时，采用铕纳米技术捕捉样品中的炭疽PA，并结合生物素-链霉亲和素放大系统，将灵敏度提升为酶联免疫吸附法的100倍。

图3 基于纳米颗粒的TRFIA测定原理[38]Fig.3 Determination principle of TRFIA based on nanoparticles[38]

近年来，时间分辨荧光材料在荧光共振能量转移技术以及比率荧光分析法中的应用成为一种发展趋势。镧系稀土元素荧光标记物寿命长、Stokes位移较大的优势弥补了FRET供受体荧光相互干扰的不足。以磷酸三丁酯（TBP）-Eu3+和别藻蓝蛋白（APC）为标记物建立的荧光共振能量转移TRFIA是目前成功的均相分析体系之一。Hepojoki等[39]利用荧光共振能量转移TRFIA技术检测汉坦病毒，发现这种新型结合技术在病毒研究方面有很大的应用价值。杨伟强等[40]基于四环素对碳点和铕（Eu3+）的不同影响，建立了一种肉眼可辨的比率荧光分析法检测四环素残余量，操作方便，灵敏度高。

展望现有技术，时间分辨荧光材料具有广阔的发展前景和上升空间，一方面需要在原有基础上进一步提高检测灵敏度，另一方面需要结合荧光共振能量转移技术、比率荧光分析法等进一步深入发展。

2 新型荧光标记材料

2.1 上转换发光纳米材料

上转换发光纳米材料（upconverting nanoparticles，UCNPs）是一种能够接收低能量激发光并将其转换成高能量发射光的新型荧光探针材料。上转换发光纳米材料采用近红外作为激发光源，具有发射光谱特性突出、荧光量子产生率高、反斯托克位移大、荧光寿命长等特点。相对于传统以有机染料和半导体量子点为代表的下转换发光材料，上转换发光材料毒性较低，能在提高对生物组织的穿透深度同时减少长时间照射引起的伤害，消除来自内源性荧光物质和同时标记荧光染料的背景荧光干扰，具有较高的灵敏度和选择性[41]。基于UCNPs的上转换发光纳米技术（upconversion fluorescence nanoparticles technology，UPNT）能解决食品污染物传统检测方法中样品前处理程序复杂等问题，快速有效地对一些食品污染物进行检测[42]。

上转换发光具有多种发光体系，而稀土掺杂（rare-earthdoped，RED）体系是目前效率最高、应用最多的上转换发光体系。稀土掺杂上转换纳米粒子具有特殊的频率上转换能力，主要利用镧系稀土离子（如Yb3+和Er3+）之间的能量转移来实现长波长激发光到短波长发射光的转换，与其他上转换纳米材料相比灵敏度更高。Sheng等[43]结合磁性分离技术建立了阿特拉津的高灵敏度荧光免疫分析方法。如图4所示，该方法以亲水性NaYF4:Yb/Er UCNPs与抗阿特拉津抗体结合作为信号探针，聚苯乙烯磁性微球与包被抗原结合作为捕获探针，可用于玉米、大米和甘蔗汁基质中阿特拉津的定量检测，在玉米和大米样品中的检测限为20 ng/kg，在甘蔗汁样品中检测限为2 ng/L。该方法也能识别丙嗪和异丙嗪，因此可用于对三种除草剂的同时检测。

图4 探针的制备过程和使用竞争模型的荧光免疫分析方法的检测原理[43]Fig.4 Preparation process of the probes and test principle of the fluorescence immunoassay using a competitive format[43]

上转换发光纳米材料的激发和发射光谱较窄，凭借自身优异的光化特性成为FRET的理想能量供体。张莹莹等[44]通过上转换荧光纳米材料与金纳米粒子之间的荧光共振能量转移建立了赭曲霉毒素A（OTA）适配体传感器，实现对OTA的定量检测。将UCNPs及AuNPs分别修饰OTA适配体和互补链制成能量供体探针及受体探针，在最优条件下检测范围为0.001～10 ng/mL，检出限可达0.001 ng/mL。特异性研究及加标回收实验证明，该方法可用于实际样品检测，具有灵敏度高、特异性好、操作简单、成本低的优点。

上转换发光纳米材料制备成本较高，且本身不具有亲水键和活性基团，在应用过程中必须进行表面修饰[45]或合成水溶性稀土化合物[46]。作为一类新型荧光标记材料，上转换发光纳米材料尚存在巨大的发展空间。基于上转换发光荧光免疫分析技术的食品污染物检测方法在发射光的可调节性方面已取得了近红外区激发-可见光区发射、近红外区激发-近红外区发射等成果，但仍具有极大的开发潜力。已有研究通过改变镧系掺杂剂改变上转换纳米探针的光学性质并实现了双色上转换纳米探针的制备[47]，但双色探针仍不能满足多组分分析对检测效率的需求，需对多色上转换纳米探针的研发和应用予以更多关注。

2.2 磁性荧光纳米材料

磁性纳米颗粒（magnetic nanoparticles，MNPs）具有快速磁响应性，可用于复杂基质的样品前处理中，以实现对待测物的高效分离和富集[48−50]。磁性荧光纳米材料是一种双功能复合纳米材料，常采用稳定的核壳式结构，以Fe3O4等磁性材料为内核，SiO2、C、TiO2等无机材料为夹层，在其内部或表面吸附有荧光素、量子点等荧光材料后经表面修饰制成。这类复合材料实现了免疫磁分离和荧光免疫分析两个过程的合并，大大简化了检测过程，有望解决一些荧光标记物在标记后难以分离的问题，提高检测的准确性，在食品污染物的免疫分析中具有潜在应用价值[51]。Huang等[52]以荧光磁性纳米管为标记物，建立了猪尿基质中克伦特罗的磁性荧光免疫分析方法（如图5），其定量检测的范围为0.25～5 ng/mL，在磷酸盐缓冲盐和猪尿样品中具有相似的检测限，分别为0.22和0.16 ng/mL，灵敏度比传统的胶体金试纸条高4倍。该方法的检测结果与液相色谱-串联质谱法高度相关，与其他8种高浓度β-肾上腺素受体激动剂区分时也表现出了很强的特异性，可应用于其它的β-肾上腺素激动剂残留的检测。

图5 IMS–FLFIA的步骤示意图[52]Fig.5 Schematic illustration of the IMS–FLFIA process[52]

然而，磁性材料在提供磁性的同时会引起荧光猝灭，夹层材料的引入能在一定程度上降低影响，但也带来了粒径增加和磁响应性降低的问题，仍需寻找最佳的材料组合及组装方式，在引入其他性能的同时实现对原有性能的保持或增强[53]。Fe3O4应用于荧光磁性纳米材料时，其内部过滤效应也可能会对检测产生干扰。Huang等[54]在磁珠表面共价偶联量子点制成磁性荧光纳米微球，构建了检测E.coliO157:H7的荧光免疫分析方法，通过控制微球和单克隆抗体的浓度获得最大的发光强度，有效减弱了材料的内部过滤效应，在试纸条上检测限达到2.39×102CFU/mL。作为一种新型复合材料，磁性荧光纳米材料在材料组合、组装方式、表面修饰等方面仍需进一步的研究，以改善其分析性能、简化其制备工艺、降低其使用成本，真正运用于实际监管与筛查工作中。

2.3 荧光蛋白标记材料

荧光蛋白最初来源于自然界，天然无毒，主要分为绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白3种类型[55]。荧光蛋白是一种新型荧光标记物，克服了传统荧光标记物荧光背景高、易猝灭等缺点，不易受生物样品自身荧光干扰，量子产率高，吸收带谱宽，几乎覆盖所有可见光范围，提高了荧光蛋白标记选择的灵活性，目前已广泛应用于免疫分析检测领域[56]。

荧光蛋白与量子点等传统荧光材料不同，它不需要任何化学修饰，简化检测步骤，更方便迅速。Riikka等[57]将伏马菌素模拟体克隆为一种黄色荧光蛋白的融合蛋白，无需标记或二次抗体，可直接作为FB1检测的示踪剂，再结合AuNPs的荧光猝灭能力，可在一个步骤中进行均相免疫分析。得到FB1动态范围为7.3～22.6 ng/mL，检测限为1.1 ng/mL，IC50值为12.9 ng/mL，灵敏度较高，可用于检测食品中霉菌毒素。王盛等[56]制备了一种检测植物病毒烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV）的藻红蛋白免疫荧光探针，其中应用的蛋白质交联技术是藻胆蛋白荧光探针研制和应用的关键。如图6，通过利用双功能试剂SPDP在蛋白质分子中引入巯基，结合2-巯醇吡啶分析方法，定量测定引入活性基团比例，制得珊瑚藻R-藻红蛋白（r-phycoerythrin,R-PE），再用珊瑚藻R-藻红蛋白标记羊抗兔抗体，以硝酸纤维素膜为固相载体，用于烟草花叶病毒的检测。

图6 交联反应流程[56]Fig.6 Crosslinking reaction process[56]

虽然荧光蛋白标记让免疫检测过程更便捷经济，但其灵敏度低的问题也不容小觑。以生物素偶联抗体或抗原，以亲合素标记示踪物，是免疫反应中通用的放大手段。为提高藻胆蛋白免疫荧光法检测的灵敏度，吴萍等[58]引入桥式亲合素-生物素系统（BRAB），通过将ELISA法与藻胆蛋白免疫荧光直接法、桥式BAS法相结合，利用桥式BAS的二级信号放大作用，最终得到血清中HBsAg的检测率提高了1.5倍。当然，除了该方法之外，对反应条件的优化或是以惰性材料微球替代NC膜为固相载体进行富集反应，又或是采用双抗体夹心法等也是提高检测灵敏度的途径[56]，还需进行进一步研究。

3 前景与展望

食品污染物中，除了常见的农药、兽药、真菌毒素、有害微生物等，更多新型污染物也在不断产生。为对食品污染物进行快速、定量的低成本、大批量筛查，基于免疫分析技术建立了许多食品污染物的检测方法。其中，胶体金免疫层析法发展较为成熟，但存在灵敏度不足、难以定量等问题。荧光免疫分析技术的高灵敏度很好地弥补了这些不足，符合免疫分析技术定量、快速、智能化的发展趋势。荧光素是最先应用于荧光免疫分析技术的标记材料，但其稳定性和信号强度未能令人满意。以特定载体材料将荧光素包裹成荧光微球是提高其稳定性和信号强度的一种解决方案；量子点、时间分辨荧光微球等标记材料的引入也改善了荧光免疫分析技术的稳定性和准确性。量子点荧光信号强而稳定，可实现多色标记；时间分辨荧光微球荧光寿命长，灵敏度高。上转换发光纳米材料、磁性荧光纳米材料、荧光蛋白等新型标记物功能性较强，但其在成本、成熟性方面有待改善。基于荧光免疫分析技术的食品污染物检测方法，其主要发展方向如下：

一是多重定量检测。在实际检测中，多种污染物往往同时存在于一种食品中（如多种真菌毒素同时存在于粮食中），需要进行多组分同时分析以提高效率。多色荧光微球和彩色量子点在多组分分析方面具有显著优势，以其作为标记物建立对特定食品基质的多组分分析检测方法是一大发展趋势。

二是新型标记材料的研发。研发新型标记材料是提高检测结果准确性，实现定量、半定量分析的重要途径。现有的新型标记材料往往成本较高，难以在现实检测场景中得到广泛应用，需要对其制备方法进行改良以降低成本；结合其他材料的特性，研制多功能复合材料也是新型标记物研发的重要方向，如磁性荧光材料将免疫磁分离与荧光免疫分析两个步骤结合在一起，在提升检测效果的同时大大简化了检测过程。

三是改善检测环境和预处理方法。食品基质成分较为复杂，对荧光免疫分析造成了一定的干扰。改善检测环境可以在一定程度上减弱基质带来的干扰、提高检测结果准确性；改良样品预处理方法还可以使整个检测过程更加便捷。

四是便携式读取仪器的研发和检测方法智能化。多数商品化的荧光读取仪器较为笨重，对操作者专业知识也有一定要求，并不适合现场筛查。进入信息化时代，不仅要实现读取仪器便携化，还要实现检测过程自动化和检测方法智能化。将荧光免疫分析技术更好地与信息技术结合起来，可以为食品污染物的日常筛查提供更有力的技术支持。