桦褐孔菌多糖对小鼠的降血糖研究

赵佳茜，朱长俊，刘兰，杨邱娴，田建霞

（嘉兴学院生物与化学工程学院，浙江嘉兴 314000）

桦褐孔菌具有多种药理活性成分如多糖、萜类、酚酸类、黑色素类及木质素药用真菌，被应用于糖尿病、癌症等多种疾病的防治和治疗，且长期的动物实验及临床实验表明使用桦褐孔菌无毒副作用[1]。糖尿病是一种代谢性疾病，通常会对肾脏造成不可逆的伤害。使用合成药物会产生低血糖、胃肠道不适、腹泻、肥胖、皮疹、腿部或脚踝肿胀以及乳酸中毒等不良反应或毒副作用。天然药物及其有效成分在治疗糖尿病方面作用温和、稳定、持久且毒副作用比较低，对天然药物降血糖活性成分的发现为糖尿病患者的预防治疗和康复提供了新的途径[2]。

本实验室在前期进行了大量实验确定了使用60%醇沉时得到桦褐孔菌多糖的含量与活性最高的基础上使用多糖对经由腹腔注射造模而成的糖尿病模型小鼠进行降血糖实验，对小鼠血清中甘油三酯（TG）含量进行对比，对其进行更加全面的研究，以弥补当前国内关于桦褐孔菌研究上的缺乏。

1 材料与方法

1.1 实验材料

40 只SPF 级别C57BL/6J 雄性小鼠，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，饲养于嘉兴学院医学院SPI 级动物房；桦褐孔菌，购于杭州百山祖生物科技有限公司。

1.2 试剂与仪器

α-葡萄糖苷酶，合肥巴斯夫生物科技有限公司；无水碳酸钠、葡萄糖、硫酸、苯酚，上海凌峰化学试剂有限公司；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG），上海源叶生物科技有限公司；四氧嘧啶，阿拉丁公司；盐酸二甲双胍，上海生工生物工程技术服务有限公司。以上试剂均为分析纯。

UV-1100 紫外分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵，河南省予华仪器有限公司；血糖仪和血糖试纸，三诺生物传感股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桦褐孔菌多糖的提取

取桦褐孔菌子实体100.0 g，加1 000 mL 去离子水，加热2 h，补充损失的水分。三层纱布过滤2 次，抽滤2 次，弃滤渣，得水提物，40 ℃烘干，称取4.00 g，去离子水定容至50 mL，取2.5 mL 于离心管中，再加入3.75 mL 无水乙醇，使乙醇的体积浓度为60%，混匀，4 000 r/min 条件下离心20 min，回收沉淀并烘干，得60%乙醇沉淀粉末备用。

1.3.2 桦褐孔菌水提物的多糖含量测定

取6 只试管，分别加入0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL 葡萄糖溶液（0.1 mg/mL），加去离子水至1.0 mL，加苯酚溶液（50 g/L）1.0 mL、浓硫酸5.0 mL，混匀，静置10 min，沸水浴15 min，冷却15 min，于485 nm 处测定吸光值，以去离子水作为参比溶液，绘标准曲线；取25 mg 粉末定容至25 mL，取1.0 mL，方法同上，测定吸光值，计算多糖含量[3]。

1.3.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性的检测

1 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液；5 mmol/L PNPG 溶液；0.2 mol/L Na2CO3溶液；pH 为6.8 的磷酸缓冲液；按表1 的方式进行添加（PNPG 和α-葡萄糖苷酶均用磷酸缓冲液溶解）。

表1 体外抑制α-葡萄糖苷酶活性实验溶液添加

表2 小鼠分组情况

取400 μL 样品于试管中，加入20 μL 的α-葡萄糖苷酶溶液，37 ℃保温10 min，再加入PNPG 200 μL 启动反应，37 ℃保温30 min 后加入5 mL Na2CO3终止酶反应过程，405 nm 处测吸光值，以去离子水作为参比溶液，每组3 次，记为A1；磷酸缓冲液代替样品溶液作为空白对照，记为A0；磷酸缓冲液代替PNPG 溶液，记为A2。根据公式（1）计算抑制率[4-5]。

1.3.4 小鼠糖尿病病理模型建立

小鼠适应环境7 d，禁食不禁水16 h，测体重，尾尖取血，测空腹血糖；腹腔注射四氧嘧啶溶液0.24 mg/g，注射3 d 后，小鼠再次禁食不禁水16 h，测体重和空腹血糖。

1.3.5 小鼠造模后给药分组

上述小鼠随机分为5 组，每组8 只，见表2。每7 d测量一次体重和空腹血糖。

表1 多糖含量

表2 多糖抑制率

1.3.6 葡萄糖耐受性及胰岛素敏感性实验

小鼠禁食不禁水12 h 后，测体重和空腹血糖，此时血糖为小鼠注射0 min 的血糖值。适应0.25 h，开始腹腔注葡萄糖溶液，剂量为2 g/kg。注射后0.25 h、0.50 h、1.00 h、1.50 h、2.00 h、2.50 h 和3.00 h 测量小鼠的血糖值；将小鼠禁食不禁水6 h，测体重和空腹血糖，此时血糖为小鼠注射0 min 的血糖值。适应0.25 h，开始腹腔注射胰岛素溶液，剂量为5×10-4U/g。注射后0.25 h、0.50 h、1.00 h、1.50 h、2.00 h、2.50 h和3.00 h 测量小鼠的血糖值。

1.4 数据统计分析

实验数据以“平均值±标准误”表示，用SPSS软件进行描述性分析、t检验分析，检验水准α=0.05，P＜0.05 为有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 桦褐孔菌多糖含量测定及对α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响

经测定得图1 溶液中葡萄糖浓度和吸光值成线性关系为y=16.76x-0.003 4，R2=0.999 8。经过9 组实验后，计算出桦褐孔菌多糖的平均含量为15.31%。多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率达到75.42%。

图1 葡萄糖标准曲线

2.2 糖尿病小鼠模型建立

在使用四氧嘧啶连续注射3 d 后，小鼠空腹血糖在13.9 ～17.3 mmol/L，高于11.1 mmol/L，表明糖尿病小鼠模型构建成功。

2.3 桦褐孔菌多糖对糖尿病小鼠的影响

如图2 所示，使用桦褐孔菌多糖（二甲双胍为阳性对照，生理盐水为阴性对照）连续灌胃21 d，对照组小鼠血糖明显升高，其余4 组小鼠血糖显著下降，说明桦褐孔菌多糖具有良好的降血糖的作用。高浓度组与二甲双胍组小鼠血糖无明显差异，说明该剂量桦褐孔菌多糖和相当浓度的二甲双胍具有相当的降血糖效果。

图2 小鼠血糖变化图

2.4 小鼠葡萄糖耐受性、胰岛素敏感性分析

小鼠注射葡萄糖后血糖变化如图3 所示，在0 ～0.5 h 内血糖升高，0.5 ～2.5 h 血糖下降，二甲双胍组、中浓度组和高浓度组在注射1.5 h 后血糖恢复到初始水平，低浓度在2.0h 恢复正常，对照组在2.5 h 恢复初始，说明桦褐孔菌多糖可以增强小鼠的葡萄糖耐受能力。

图3 葡萄糖耐受性测试

图4 为注射胰岛素以后血糖浓度，二甲双胍组、中浓度组和高浓度组均在1.5 h 恢复到初始水平，而低浓度组和对照组的恢复时间是2 h，说明桦褐孔菌能够提高胰岛素敏感性。综合葡萄糖耐受性、胰岛素敏感性分析，桦褐孔菌多糖能够增强小鼠的葡萄糖耐受能力和胰岛素敏感能力，快速促进小鼠紊乱的糖代谢恢复正常，进而抑制糖尿病的恶化。该剂量中、高浓度组的桦褐孔菌多糖具有相当浓度的二甲双胍恢复紊乱的糖代谢的效果。

图4 胰岛素敏感性测试

3 结论

桦褐孔菌多糖对于糖尿病病理性小鼠有明显的降血糖作用，可以增强小鼠的葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性。桦褐孔菌多糖对于糖尿病的干预作用可能来源于其对于小鼠紊乱的糖代谢快速促进恢复正常，进而抑制糖尿病的恶化。本研究可以为将来探究桦褐孔菌多糖对于糖尿病的干预作用机理奠定一定的基础。