聚合酶螺旋反应检测肺炎克雷伯菌与临床样本评价

王泉，马瑞瑛，杨婷，张亚丽，许苗，撒玉玲，陈清波

（新疆医科大学第八附属医院检验科，新疆乌鲁木齐 830049）

肺炎克雷伯菌是一种常见的院内感染致病菌，可引起较严重的下呼吸道感染甚至死亡[1-2]，在婴儿、肿瘤患者等长期使用抗生素的病人或免疫力较差的老年人中发病率较高。临床症状与其他院内感染细菌无明显差异，难以实现通过临床症状对该菌的精准判断[3]，目前临床上针对肺炎克雷伯氏菌的检测方法主要是以传统的培养法结合生理生化鉴定或使用最新的全自动细菌鉴定仪，一般需要2 ～3 d，耗时较长。其操作的便捷性、时效性及灵敏度无法满足临床上快速精准诊断的要求[4-5]，因此需要建立一种快速灵敏的检测方法来实现对该菌的鉴定。

近年来，一系列分子生物学技术也被用来进行肺炎克雷伯菌的检测，如聚合酶链式反应（PCR）、多重PCR 和实时荧光定量PCR 等技术[6-8]。但此类方法需要专业的技术人员和精密的温控设备，同时PCR技术中使用的Taq 酶活性易受到待检样本中的抑制物影响而降低甚至失活，造成检测结果不准确[9]。近年来发展的恒温扩增技术（如环介导等温扩增技术、聚合酶螺旋反应等）是利用BstDNA 聚合酶的作用实现核酸扩增，受待检样本中抑制物影响较小而在临床微生物检测中广泛应用。

聚合酶螺旋反应（PolymeraseSpiralReaction，PSR）技术因其操作简单，耗时短，具有较高的特异性及灵敏度的优势在病原微生物快速检测方面发展迅速，相关学者已成功将PSR 技术应用于食源性致病菌、痰液样本中结核分枝杆菌等致病菌的检测。PSR的原理是利用微生物的特异性核酸序列设计4 条引物（2 条检测引物，2 条加速引物）识别目标基因5个不同区域，利用BstDNA 聚合酶的活性及核酸分子在63 ℃处于半解离半平衡状态实现恒温条件下快速扩增DNA 分子。

在精准医学高速发展的今天，肺炎克雷伯菌传统痰培养检测法已无法满足要求。本研究基于肺炎克雷伯菌外膜蛋白一段特异性基因设计PSR 反应引物，对引物进行筛选，并对其菌株特异性和最低检出限进行评价。于2019 年9—12 月间在新疆医科大学第八附属医院（原新疆维吾尔自治区胸科医院）连续收集270 份疑似呼吸道感染患者的痰液样本，比较PSR基因检测及痰培养检测两种方法的差异性，评价PSR恒温检测在呼吸道肺炎克雷伯菌感染诊断中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

试剂：DNA 提取液，广州迪澳生物科技有限公司；BstDNA 聚 合 酶，New England Biolabs；SYTO 9，宝生物工程（大连）有限公司；肺炎克雷伯氏菌核酸测定试剂盒（荧光PCR法），上海之江生物科技有限公司；血平板、巧克力平板和麦康凯平板，赛默飞公司。

细菌及来源：金黄色葡萄球菌ATCC11987，大肠埃希氏菌CMCC44102，肺炎链球菌CMCC31001，铜绿假单胞菌ATCC9027，鲍曼不动杆菌ACCC11038，肺炎克雷伯氏菌ATCC4352，嗜麦芽窄食单胞菌BNCC106909，流感嗜血杆菌CMCC585283，嗜肺军团菌ATCC33152，结核分枝杆菌BNCC104756，单核增生李斯特菌ATCC19115，创伤弧菌ATCC27562，肠炎沙门氏菌5186，小肠结炎耶尔森菌ATCC23715，志贺氏菌Q1030，大肠埃希氏菌O157 ATCC700728，蜡样芽孢杆菌NCTC7997，阪崎肠杆菌ATCC29004，阴沟肠杆菌BNCC353685，均购自北纳生物科技有限公司。

仪器：QuantStudio™6 实时荧光定量PCR 仪，美国ABI；VIEK 2 COMPACT 全自动微生物鉴定系统，法国梅里埃。

1.2 引物设计与合成

对肺炎克雷伯氏菌基因通过Blast 比对获得特异性片段（KPN_04473，Genebank accession No. CP000647），根据PSR 反应扩增原理使用PrimerExplorer 进行引物设计[10]，设计结果如表1 所示。其中F1、B1 为检测引物，IF 及IB 为加速引物。所有引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成，其中F1，B1 采用HPLC方式纯化，IF 及IB 采用PAGE 方式进行纯化。

表1 PSR 所用引物序列

1.3 样本DNA 的制备

对收集的临床痰液样本，在痰样中加入等体积痰液液化剂（含有N-乙酰-L-半胱氨酸1.0%，乳化剂0.25%，EDTA10 mmol/L）后涡旋震荡混匀，室温下放置15 min，吸取1 mL 加入带旋盖的离心管中，以10 000 g 转速离心5min，弃去上清液。随后加入100 μL 的DNA 提取液并混合均匀，100℃热裂解10 min。10 000 g 离心2 min，待冷却至室温后将上清液转移至新的离心管中备用，其中2 μL 作为核酸扩增的模板。

1.4 PSR 反应体系

PSR 反应体系为25 μL。各组分浓度具体如下：10.0 mmol/L KCl，20.0 mmol/L Tris-HCl，0.1% Triton X-100，0.8 mol/L 甜菜碱，10.0 mmol/L（NH4）2SO4，8.0 mmol/L MgSO4，1.4 mmol/L dNTPs，8 U BstDNA 聚合酶，F1 及B1 各1.2 μmol/L，IF 及IB 各0.8 μmol/L，DNA 模板2 μL，SYTO 9 体积为0.5 μL，双蒸水补齐至25 μL。

1.5 菌株特异性评价

使用如1.1 描述18 种致病菌对反应体系进行验证。按照1.3 中描述使用DNA 提取液对目标菌株及其他菌株的DNA 模板进行提取，加入2 μL 的DNA模板至PSR 反应体系中，以双蒸水进行对照，在荧光定量PCR 仪器上于63 ℃反应60 min。

1.6 最低检出限分析

将初始浓度为106CFU/mL的肺炎克雷伯菌的菌悬液采用10 倍稀释法将其浓度依次稀释至105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL、102CFU/mL 和10 CFU/mL。将上述不同浓度的1 mL 菌液样本以10 000 g 转速离心5 min，弃上清液。加入100 μL 的DNA 提取液，100 ℃加热10 min。10 000 g 离心2 min，将上清液转移至新的离心管中备用，取2 μL 上清液用于核酸扩增。在荧光定量PCR 仪器上于63 ℃反应60 min，以确定检测下限。

1.7 结果判读

通过荧光定量PCR仪采集荧光值自动计算Ct值。无Ct值时，判定为阴性；Ct值≤55 判定为阳性；55 ＜Ct值≤60，建议复核样本，若Ct值≤55 或仍在此区间，样本为阳性，否则为阴性。

1.8 临床样本的检测

于2019 年9—12 月新疆医科大学第八附属医院（原新疆维吾尔自治区胸科医院）连续收集270 份疑似呼吸道感染患者的痰液样本。采用吸痰或深咳法将痰液样本留取于痰培养瓶内。将涂片革兰氏染色镜检合格的痰液（白细胞＞25 个/HP，鳞状上皮细胞＜10 个/HP 为合格，采集痰液样本均合格）转接至血琼脂平板进行培养，随后使用VIEK 2 COMPACT全自动微生物鉴定系统进行菌种鉴定。以鉴定结果作为最终判读标准，与PCR 方法进行对比验证，以评估该方法的临床适用性及差异性。

2 结果与分析

2.1 引物筛选结果

使用上述PSR 体系及引物浓度进行核酸扩增反应，第1、2、3 和4 套测定的Ct值分别为19.5、15.3、26.2 和49.6，4 套引物中第2 套引物相对于其他引物Ct 值小，说明此引物扩增效率较高，适用于后续实验。

2.2 菌株特异性与最低检出限实验

基于PSR 反应原理构建的恒温体系扩增肺炎克雷伯菌梯度浓度模板时，在浓度为10 CFU/mL 时无Ct值，检测结果为阴性；浓度为102CFU/mL 时，Ct值为30，检测结果为阳性，说明该反应体系最低检测浓度为102CFU/mL。使用肺炎克雷伯菌及非目标菌株的DNA 模板进行扩增，18 种特异性菌株均为阴性，且阴性对照无非特异性扩增。综上所述，所筛选出第2 套引物具有较佳的菌株特异性，最低检出限为102CFU/mL。

2.3 临床样本效果评价

从痰培养肺炎克雷伯阳性的54 份痰液DNA 模板样本中，PSR 体系检出52 份阳性，2 份阴性。其中2 份培养阳性而PCR 检测为阴性可能是由于痰样本中菌量分布不均，未达到反应体系的最低检出限，导致其检测结果为阴性。从痰培养检测结果为阴性的216 份样本中，PSR 检出16 份阳性，200 份阴性。将这16 份样本经高保真扩增测序比对后均为肺炎克雷伯菌，说明PSR 相对于传统培养法有更高的敏感度。以痰培养法作为标准，其敏感度为96.30%，特异度为92.59%，阳性预测值为76.47%，阴性预测值为99.01%，总符合率为93.35%（252/270），结果详见表2。

表2 以痰培养结果为参照评价PSR 检测的效能表

同商业化荧光定量PCR 试剂盒相比较，PSR 检测的敏感度及特异度分别为100%和96.63%，且两者一致性较高（Kappa=0.929 5），表明所使用的反应体系具有和荧光定量PCR 方法相似的检测效能，见表3。

表3 以荧光定量PCR 试剂盒结果为参照评价PSR 检测的效能表

3 讨论

据2013 年世界卫生组织报道，由肺炎克雷伯菌引起的腹泻是导致全球儿童死亡率居高不下的主要原因。同时，肺炎克雷伯菌的感染率占院内细菌性感染的9.03%，而临床上普遍采用的痰培养法耗时长，可能对患者的病情造成延误。

聚合酶螺旋反应已实现对白色念珠菌和结核分枝杆菌的检测。相关学者基于rcsA 基因设计PSR引物检测肺炎克雷伯菌，细菌基因组最低检出限为11.5 pg/μL（远高于培养法的检测限）[11]，可能会造成大量的漏检，无法帮助医生对病因进行准确判断而延误治疗，不符合现阶段精准医学诊断的要求。也有学者利用环介导等温扩增技术对肺炎克雷伯菌进行检测，最低检出限为103～104CFU/mL，同样高于培养法最低检出限。造成上述情况的主要原因可能是所选用的靶标基因为单拷贝基因或引物扩增效率较低。本研究所选用的靶标基为其特异性较高外膜蛋白基因，属于多拷贝基因。通过筛选的最优引物，最低检出限可达到102CFU/mL，优于目前大多数学者所构建的核酸恒温扩增体系，为提高临床肺炎克雷伯氏菌筛查的阳性检出率提供了可能。

4 结论

本研究对270 份疑似呼吸道感染患者的痰液样本，同时进行培养鉴定、PCR 检测及实时荧光定量PCR 检测。与痰培养法相比，PSR 检测肺炎克雷伯菌感染的敏感度和特异度分别为96.30%及92.59%，具有较高的敏感度及特异度；该方法与传统痰培养法的Kappa 一致性系数为0.810，显示出较高的检测性能；阳性预测值及阴性预测值可分别达到97.1%（68/70）和99.01%（200/202），表明PSR 检测结果为阳性者肺炎克雷伯菌感染的概率极高，检测结果为阴性者感染肺炎克雷伯菌概率极低，故PSR 适合于临床样本肺炎克雷伯氏菌初筛。同商业化荧光定量PCR 试剂盒检测结果相比较，PSR 仍可从荧光定量PCR 检测结果阴性样本筛查出部分阳性结果，说明该方法比所使用商业化试剂盒具有更高灵敏度。

本研究所使用的PSR 检测体系从上样到报告结果耗时小于1 h，且不需要精密的温控设备，适合现场和偏远地区基层单位的推广应用，为临床医生对呼吸道疾病诊断提供快速有效的科学依据。但随着广谱抗菌素的广泛使用，肺炎克雷伯菌对常用药物包括第三代头孢菌素和氨基糖苷类呈现出多重耐药性，本方法无法确定所筛查细菌是否具有耐药性，只能做定性分析。面临如此严峻的形势，一种快捷精准的诊断方法对相关病症的用药治疗意义重大，期待在未来能够开发基于PSR 技术的肺炎克雷伯菌耐药筛查核酸检测试剂盒。