武定乌骨鸡TYR基因多态性与黑色素沉积的关联研究*

徐志强，李丰耘，赵净颖，豆腾飞，王 坤，黄 英，葛长荣，贾俊静

(云南农业大学 动物科学技术学院，云南 昆明 650201)

黑色素是一种由黑色素细胞分泌的酪氨酸酶(TYR)催化体内酪氨酸羟化合成的聚合物，拥有复杂的结构。黑色素生成由酪氨酸经酪氨酸酶催化下转化为多巴(即3,4-二羟基苯丙氨酸，DOPA)，多巴在酪氨酸酶的作用下进一步氧化为多巴醌(DQ)，多巴醌经多聚化反应与氧化反应生成多巴色素，多巴色素经过羧化和脱羧化形成中间体5,6-二羟基吲哚(DHI)和5,6-二羟基吲哚羧酸(DHICA)，之后二者在酪氨酸酶及其相关蛋白的作用下形成中间产物5,6-吲哚醌(IQ)和5,6-吲哚醌羧酸(IQCA)，最后2 种中间产物结合形成的异聚体即为真黑色素(eumelanin)。而在酪氨酸氧化刚开始形成的多巴醌有谷胱甘肽和半胱氨酸的参与后，产生谷胱氨酰多巴和谷胱氨酰多巴醌，最后形成褐黑色素(pheomelanin)[1-3]。黑色素主要由真黑色素和褐黑色素(pheomelanin)混合而成。TYR 是影响黑色素生成的限速酶，由酪氨酸酶(TYR)基因编码[4]。一些研究表明：TYR基因与家鸡黑色素沉积有关[5-6]。陆晓屏等[5]研究不同羽色他留乌骨鸡(麻羽、白羽和黑羽)的TYR基因多态性，发现他留乌骨鸡TYR基因变异与羽毛性状显著相关。赵振华等[6]研究显示：配对框3 (Pax3)和TYR基因的表达与肉鸡胫皮肤黑色素高度沉积有关，Pax3下调可以促进TYR的表达，从而使黑色素细胞的黑色素生成增加。

武定鸡主产于云南省楚雄彝族自治州的武定和禄劝两县，属于地方肉用型鸡种，具有体大、肉质肥嫩和鲜美等特点[7]。武定鸡的肉、肤颜色分为乌和非乌2 种，武定鸡乌肉、肤的形成可能与其黑色素的沉积有关。据武定县史料记载，现存的武定鸡是由山东引进的‘九斤黄’与武定县本地土鸡进行自然杂交，并经过民间长期饲养(自然选择和淘汰)而形成的地方优良品种[8]。因武定鸡繁育体系存在血缘混杂化以及人们对乌骨鸡的喜爱，所以对武定鸡的乌骨品系选育极为重要。本研究选用武定乌骨品系鸡和非乌骨品系鸡为试验动物，在相同饲养条件下，测定300 日龄时2 个品系鸡的血浆TYR 活力、总黑色素含量以及血浆比色OD 值等黑色素指标；采用直接测序法分析武定鸡TYR基因外显子的多态位点(SNP)；并测定鸡种各组织中的TYR基因mRNA 表达量，比较两品系间的差异。本研究旨在找出两品系(乌骨和非乌骨)武定鸡TYR基因外显子的差异SNPs 位点，以期为乌度更深的武定鸡的选育提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

武定鸡种鸡群是从禄劝县和武定县交通不畅的乡镇选购种鸡所组建的核心群，并经过7 个世代于云南农业大学后山鸡场进行闭锁继代选育所得的种鸡群。本试验选取400 只300 日龄健康的武定乌骨品系鸡为主要研究对象(试验组)，以400 只武定非乌骨品系鸡为对照。武定鸡繁育饲养在云南农业大学教学实习鸡场，饲养环境条件相同，并按期接种疫苗。试验鸡日粮参照《NY/T 33—2004 鸡饲养标准》[9]及美国NRC 饲养标准配制。

1.2 试验方法

1.2.1 肤色分群

通过使用色彩色差仪对九阶灰度卡(图1)9 个灰度(1～9 号)以及纯白(0 号)和纯黑(10 号)进行检测(表1)，按照L*(亮度)值划分白肤[L*＞3 号(L*=71.770)]和乌肤[L*＜5 号(L*=54.850)]的标准，并结合九阶灰度卡通过肉眼对武定鸡进行肤色分群(组)。

表1 九阶灰度卡对应L＊值Tab.1 Nine grayscale cards correspond to L values

图1 九阶灰度卡)Fig.1 Nine-order grayscale card

1.2.2 样品采集

300 日龄时挑选已通过肤色分群的两品系武定鸡母鸡各150 只(总共300 只)，提前禁食12 h后，清晨使用真空抗凝血管(含EDTA2K 抗凝剂)对武定鸡翅下静脉采集血液。一部分血液离心获得血浆(3 000 r/min 离心30 min，取上清)，分离的血浆用于黑色素指标的测定；另一部分血液用于提取基因组DNA。随机挑选两品系武定鸡母鸡各20 只进行屠宰，提前12 h 禁食禁水，颈动脉放血，采集胸肌、腿肌、心、肝、脾、肾、肌胃和背部皮肤等组织样放入冻存管内，置于液氮中速冻后转入-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.3 血浆TYR 活力和总黑色素含量测定

血浆TYR 活力和总黑色素含量的测定使用ELISA 试剂盒(上海羽朵生物科技有限公司)和酶标仪进行检测。

1.2.4 血浆颜色的测定

将血浆与生理盐水以1∶7 的体积比混合后，以生理盐水为空白对照，使用酶标仪在波长475 nm 处测吸光值。

1.2.5TYR基因PCR 测序

(1) 血液DNA 提取

使用DP304 TIANGEN 血液DNA 提取试剂盒(TaKaRa 宝生物工程有限公司)提取基因组DNA。

(2) 引物设计

利用ENSEMBL (http://asia.ensembl.org/index.html)和NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov)选择红色原鸡TYR基因序列(序列号：NM_204160)，利用DNAMAN 设计本试验所有外显子区域引物，引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成，引物序列见表2。

表2 引物序列及具体信息Tab.2 Primer sequence and specific information

(3) PCR 反应

PCR 反应体系：DNA 模板1 μL，2×TSINGKETM Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L Primer F 0.5 μL，10 μmol/L Primer R 0.5 μL，dd H2O 11 μL。PCR 反应条件：94 ℃变性 5 min 后，94 ℃ 30 s，55～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共 35 个循环；最后 72 ℃保温 7 min。

1.2.6TYR基因表达量的检测

(1) 总RNA 提取及cDNA 合成

RNA 提取及cDNA 合成均参照试剂盒(TaKa-Ra 宝生物工程有限公司)说明书进行。(2) Real-time PCR 检测目的基因相对表达量通过上述试验获得的cDNA 为模板，使用引物设计软件primer 5.0 设计TYR基因及内参β-actin的引物，引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成，信息见表3。

表3 实时荧光定量PCR 引物信息Tab.3 Real-time fluorescence quantitative PCR primer information

1.3 数据处理分析

试验数据利用Excel 2016 进行分类整理，再用SPSS 21.0 和SAS 9.2 软件进行独立性样本t检验。

TYR基因单个SNP 位点不同基因型，模型Yijkl=μ+GEN1i+GEN2j+TYPEk+el中，Yijkl代表性状观察值；μ代表群体均数；GEN1i和GEN2j分别为C2744T 和C2866T 位点的基因型效应；TYPEk代表血浆中黑色素相关指标含量；el代表随机误差，假定服从(0，σ2)分布。根据上述模型，采用SAS 9.0 的GLM 过程进行数据统计分析，结果以“最小二乘法数±标准误”表示。

荧光定量所得数据用Ratio=2-Ct(TYR)/2-Ct(β-actin)计算出目标基因表达。统计结果均以“平均值±标准误”的形式表示。

2 结果与分析

2.1 武定鸡血浆黑色素指标含量分析

武定鸡血浆黑色素指标的测定均使用ELISA试剂盒在酶标仪450 nm 波长条件下检测所有试验样品(n=300 只)的光密度(OD 值) (所检测标准曲线拟合度均大于0.99)。通过将酶标仪检测所得的OD 值代入标准曲线得到两组别的黑色素指标值 (表4)。通过比较分析发现：试验组血浆中的TYR 活力、总黑色素含量以及血浆比色OD 值均高于对照组，其中试验组血浆中的TYR 活力和总黑色素含量均极显著高于对照组(P＜0.01)，血浆比色OD 值显著高于对照组(P＜0.05)。

表4 不同黑色素指标之间的显著性分析Tab.4 Significance analysis of different melanin indexes

2.2 TYR 基因多态性分析

2.2.1TYR基因测序结果分析

通过对TYR基因测序结果的分析，检测到TYR-1引物上有2个SNPs：C2744T 和C2866T(图2)。检测得到的2 个突变位点，其突变均为同义突变，而其他外显子区域引物均未检测得到突变位点。

图2 武定鸡TYR 基因位点测序结果)Fig.2 Sequencing results of TYR gene locus in Wuding chicken

2.2.2TYR基因多态位点基因型和等位基因分析

对武定鸡试验组和对照组TYR基因各SNPs 位点进行群体遗传学分析，并进行卡方检验Hardy-Weinberg 平衡状态。由表5 可知：武定鸡两组别所有检测得到的TYR基因SNPs 位点(C2744T 和C2866T)均属于中度多态(0.25＜P＜0.5)，并且所有突变位点都未偏离Hardy-Weinberg 平衡，2 个突变位点都出现3 种基因型。

表5 武定鸡TYR 基因多态位点基因型及等位基因频率Tab.5 Genotype and allele frequency of polymorphic sites of TYR genes in Wuding chicken

2.2.3TYR基因SNP 位点与武定鸡黑色素相关指标含量的关联分析

利用SAS 9.2 软件将TYR基因所有突变位点的基因型和不同黑色素相关指标含量进行广义线性模型(GLM)分析。由表6 可知：TYR 活力中，最高和最低分别都为C2744T位点的CC 基因型[(35.577±3.827) U/mL]和TT 基因型[(26.431±3.770) U/mL]；C2744T 位点的CC 基因型总黑色素含量与CT 基因型存在显著差异(P＜0.05)，C2866T位点的CC 基因型总黑色素含量与CT 基因型呈极显著差异(P＜0.01)，且含量最高为C2744T 位点的CC 基因型[(700.286±27.899) U/mL]，最低为C2866T 位点的CC 基因型[(312.208±15.475)U/mL]；通过不同多态位点基因型与血浆比色光密度均值关联分析，C2744T 位点TT 基因型与CT 基因型呈显著相关(P＜0.05)，其中血浆比色光密度均值最高为C2744T 位点的CT 基因型(0.370±0.020)。

表6 TYR 基因各突变位点不同基因型和武定鸡黑色素相关指标含量关联分析Tab.6 Association analysis of different genotypes at each mutation site of TYR gene and melanin related index content in Wuding chicken

2.3 TYR 基因表达量分析

利用荧光定量PCR 仪检测武定鸡不同组织中TYR基因的表达量。由图3 可知：试验组各组织TYR基因mRNA表达量均高于对照组，其中试验组皮肤、肾脏、肝脏、心脏、肌胃和脾脏中的TYR基因mRNA表达量均极显著高于对照组(P＜0.01)，而腿肌和胸肌中的TYR基因mRNA 表达量显著高于对照组(P＜0.05)。此外，试验组TYR基因mRNA 表达量的总体趋势为皮肤＞肾脏＞肝脏＞心脏＞肌胃＞脾脏＞腿肌＞胸肌。

图3 武定鸡各组织TYR 基因mRNA 的相对表达量)Fig.3 Relative expression of mRNA in different tissues of TYR gene in Wuding chicken

3 讨论

3.1 血浆黑色素指标分析

TYR 是黑色素合成的第一限速酶，其活力决定着黑色素合成的产量、速度与种类，即真黑色素和褐黑色素的含量是由TYR 的活力来决定的，高活力的TYR 通过真黑色素的途径合成产生真黑色素，反之低活力的TYR 则合成褐黑色素[10]。真黑色素的颜色是黑色或棕色，褐黑色素的颜色是黄色或微红棕色[11]，乌骨鸡黑色素属于真黑色素[12]。本试验测定武定鸡血浆中黑色素相关指标含量，统计分析发现：武定乌骨品系鸡(试验组)血浆中TYR 活力为(35.256±2.260) U/mL，极显著高于对照组的(22.564±0.930) U/mL；血浆总黑色素含量也极显著高于对照组(P＜0.01)，而血浆比色OD 值表现为试验组显著高于对照组(P＜0.05)。由此可见，TYR 活力与生成黑色素的含量成正比，本试验结果也符合这一观点，武定乌骨品系鸡的血浆TYR 活力和总黑色素含量均极显著高于对照组，以致使黑色素沉积所导致的肉、肤色较对照组更深，整体呈乌黑的性状。而且，血浆比色的结果也符合这一现象，高活力的TYR导致乌骨品系鸡合成颜色较深的真黑色素。真黑色素最后通过血液运输至全身，最后可能导致武定乌骨品系鸡的黑色素大量沉积呈现出乌质性状。本试验所采用的检测血浆中黑色素指标含量的方法鲜有研究，所以可为黑色素的相关研究奠定基础。

3.2 TYR 基因多态性分析及其与黑色素沉积的关联分析

乌骨鸡作为保健食品颇受大众喜爱，因为引起乌骨鸡乌质性状的黑色素具有抗氧化和抗病性等作用[13]，因此利用分子遗传学技术选育乌度更深的武定乌骨品系鸡就显得极为重要。本试验通过扩增TYR基因的外显子区，共找到2 个突变位点，其突变均为同义突变。最早人们认为同义突变不存在任何意义，但对其系统研究后发现：同义突变在生命活动中同样起着非常重要的作用[14]。同义突变主要是通过RNA 的合成导致疾病的发生，例如编码球蛋白基因外显子的突变参与剪接位点的激活[15]。KOMAR 等[16]的研究得出：MDR1基因的C3435T 位点虽发生同义突变，但该突变不仅能够改变机体内部糖蛋白的构象，而且还可以改变糖蛋白的活性及与底物结合的特异性，证明同义突变虽然具有相同氨基酸序列但会合成不同结构和功能特性的蛋白质产物。CHAO 等[17]研究表明：在人类苯基丙氨酸羟化酶基因cDNA 核苷酸序列1 197 位点处发生A 突变为T 的同义突变，虽是同义突变但该突变能够诱导该基因外显子11 转录后的跳跃，最终导致苯丙酮尿症，因此说明同义突变对mRNA 转录和剪切造成影响。在两组别中，2 个多态位点均呈现遗传纯合度较高、杂合度较低的情况，并且均呈中度多态。

在早期相关研究中，YANG 等[18]对5 种具有不同羽毛颜色(纯黑羽、纯灰羽、纯白羽、水平斑羽和黑色斑点羽)的家鸡进行了TYR基因第1 外显子421 bp 片段的测序，研究表明：鸡的羽毛颜色与TYR基因的遗传变异有关。本研究对两品系武定鸡TYR基因的多态位点进行统计分析，发现2 个SNPs 位点(C2744T 和C2866T)均有3 种基因型。本试验分析了其群体遗传变异，研究结果丰富了武定鸡TYR基因的SNP 标记，为进一步深入揭示基因多态性相关研究奠定了有益基础。

张建勤等[19]采用PCR-SSCP 技术对国内外多地鸡种的TYR基因进行了遗传变异研究，检测所得突变位点C2866T 与本试验结果相同，具备前人理论基础。并且C2744T 位点的CC 基因型几乎只存在于试验组(乌骨品系鸡)中，推测该位点的CC 基因型可能与武定乌骨品系鸡的乌质性状形成有关。将两组别武定鸡的基因多态位点基因型与血浆黑色素指标进行关联分析，结果表明：TYR基因C2744T 位点的CC 基因型的血浆TYR活力均高于其他基因型，说明该突变位点的CC基因型可作为影响黑色素沉积的重要参考位点。

综上所述，可以推测出TYR基因通过影响武定乌骨品系鸡体内的TYR 活力，导致黑色素含量不同，最终造成了黑色素沉积上的不同。

3.3 TYR 基因表达量的分析

有较多的研究[20-21]表明：TYR基因参与家鸡的黑色素沉积过程。郑嫩珠等[20]研究显示：TYR基因在白绒乌骨鸡皮肤、肝脏和肌肉等组织中的表达量与其黑色素含量呈显著正相关(P＜0.05)，TYR基因的高表达有利于促进乌骨鸡黑色素沉积。杜晓明[21]研究显示：黑色边鸡皮肤中TYR基因mRNA表达量显著高于灰白色边鸡，羽髓中的TYR基因mRNA 表达量极显著高于灰白色边鸡。本研究通过对乌骨品系(试验组)和非乌骨品系(对照组)武定鸡各组织中的TYR基因mRNA 相对表达量进行研究，发现TYR基因在试验组和对照组胸肌、腿肌以及皮肤等组织中均有表达，其中试验组各组织中TYR基因mRNA 表达量均高于对照组，且均存在显著性差异；另外，试验组各组织中TYR基因呈现皮肤＞肾脏＞肝脏＞心＞脏＞肌胃＞脾脏＞腿肌＞胸肌的相对表达量趋势。该研究结果与郑嫩珠等[22]研究类似，其对白绒乌骨鸡各组织中TYR基因相对表达量进行研究，结果显示为皮肤＞肾＞肌胃＞肝＞肌肉，除肝脏上的表达量不一致外，其他均与本试验相符合。这可能是由于所选鸡种、日龄或内参基因不同所致。本研究结果表明：与对照组相比，试验组各组织中高表达的TYR基因使其具有较高的黑色素沉积。由此可见，TYR基因是调控家鸡黑色素生成的关键基因，在黑色素沉积中发挥重要作用。

4 结论

武定乌骨品系鸡血浆TYR 活力、总黑色素含量以及血浆比色值均高于武定非乌骨品系鸡，TYR基因外显子中C2744T 的CC 基因型可能是影响武定鸡乌质性状的潜在优势基因型，且武定乌骨品系鸡的TYR基因表达量极显著高于武定非乌骨品系鸡。因此，可将TYR基因作为武定乌骨品系鸡的黑色素沉积的分子标记基因运用于优质乌骨品系武定鸡的分子育种。