烟草猝倒病菌对辛菌胺的敏感性及抗性初探

钱忠海，李 涛，段亚冰

（1.江苏省农药总站，南京 210013；2.南京农业大学植物保护学院，南京 210095）

烟草猝倒病是烟草生产中一类重要的土传病害，主要危害叶片、茎部、根等。该病害是烟草苗期的重要病害，常导致幼苗感病后导致茎部呈褐色水渍状腐烂，严重时引起病苗成片萎蔫、倒伏和腐烂，给我国烟草产业带来严重的产量和经济损失。烟草猝倒病主要由腐霉属真菌引起，其中以瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）为优势致病种群，对烟草具有较强的致病性。除了侵染烟草引起猝倒病外，瓜果腐霉还能够侵染南瓜、黄瓜、番茄、大豆等多种作物[1-10]，引起巨大的经济损失。生产上防治由瓜果腐霉病引起的植物病害主要以化学杀菌剂为主，同时也有一些生防菌株或植物提取物对该菌表现出一定的活性[11-17]。

辛菌胺是一种烷基多胺类杀菌剂，主要成分是二正辛基二乙烯三胺（图1），具有广谱杀菌活性，对病原细菌、真菌和病毒都具有一定活性[18-20]。杀菌机理是辛菌胺在水溶液中发生电离，利用其亲水基部分的强烈正电性，吸附通常带负电的细菌、病毒等病原微生物，抑制其繁殖，同时能够使病菌蛋白凝固，使病菌酶系统变性，而聚合物形成的薄膜会堵塞微生物的离子通道，使其窒息死亡，从而达到最佳杀菌效果。在我国，辛菌胺目前已经在番茄、辣椒、棉花、水稻和苹果上获得登记，用于防治番茄和辣椒病毒病、水稻细菌性条斑病、稻瘟病及病毒病等生产的重要病害，但是目前还没有登记用于防治卵菌引起的植物病害。

为了进一步明确辛菌胺用于防治卵菌病害的应用潜力，笔者以烟草猝倒病病原瓜果腐霉为研究对象，分析辛菌胺对瓜果腐霉菌的抑菌活性，同时建立瓜果腐霉对辛菌胺的敏感性基线，并评估瓜果腐霉对辛菌胺的抗药性风险，力求挖掘辛菌胺用于卵菌病害防治的潜力，为生产中更好地防治烟草猝倒病提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 培养基和药剂

试验中所用培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），主要用于烟草猝倒病菌的分离、培养、病原菌对药剂敏感性的测定以及抗药性菌株的诱导。具体配制方法为：称取商品化的PDA粉剂39 g于1 000 mL水中，煮沸至粉剂完全溶解，再分装于三角瓶中，121℃条件下高温湿热灭菌25 min后备用。

药剂敏感性测定所用药剂为40%辛菌胺，由山东潍坊万胜生物农药有限公司提供，使用时用无菌蒸馏水溶解并配制成1×104μg/mL母液，并储存于4℃冰箱备用。

1.2 烟草猝倒病样品的采集及病原菌的分离培养

采用五点取样法，在未施用过辛菌胺的烟草田块中采集发生烟草猝倒病的烟草病苗。采集地点为云南省玉溪市和贵州省遵义市等地区，采集时间为2018年6月。

烟草猝倒病病原菌的分离采用常规组织分离法。首先用解剖剪在病苗茎基部的病健交界处剪取大小为5 mm×5 mm的组织块，将剪下的组织块在75%的酒精中浸3～5 s，用无菌的镊子将组织块从酒精中取出并转移至2%的次氯酸钠溶液中浸泡3～5 min，然后将其在无菌蒸馏水中连续漂洗3次以去除表面残留的次氯酸钠，并用无菌的滤纸吸去组织表面多余的水分。将表面消毒后的组织块转移至含有50 μg/mL青霉素的PDA培养基平板上，用镊子轻轻按压，每皿放3～5块。将培养皿密封好，在25℃恒温培养箱中倒置培养4～5 d，然后将长出的病原菌进行纯化和鉴定，确定为瓜果腐霉菌（P.aphanidermatum），随后在PDA平板上扩繁培养并保存备用。

1.3 烟草猝倒病菌对辛菌胺的敏感性测定

采用菌丝生长速率法测定所采集的烟草猝倒病菌对辛菌胺的敏感性。首先用融化的PDA培养基和辛菌胺母液配制含辛菌胺浓度为16.00、8.00、4.00、2.00、1.00μg/mL的PDA平板，用灭菌的打孔器在培养2 d的菌落边缘制取直径5 mm的菌碟，并将其转移至含药平板的中央，以不含药的PDA平板作为对照，每个处理重复3次。将培养皿封口后在25℃恒温条件下倒置培养2 d，测量各处理的菌落直径。各处理下菌丝生长抑制率按式（1）计算。

1.4 烟草猝倒病菌对辛菌胺的抗性风险评估

根据烟草猝倒病菌对辛菌胺的敏感性测定结果，选取对辛菌胺敏感的烟草猝倒病菌FM10作为出发菌株，进行抗性菌株的诱导，同时选取甲霜灵作为抗性诱导的对照药剂。首先在PDA平板上将FM10菌株进行活化2代，第2代菌株培养2 d后，用灭菌打孔器在菌落边缘制取直径为5 mm的菌碟2 000个，接种于含有亚致死浓度辛菌胺的PDA培养基平板上，菌丝面朝下，倒置培养于25℃黑暗恒温培养箱中，连续观察生长情况。待菌碟边缘出现扇形角突变状的菌丝长出，将角突变区的菌丝转移到含有最小抑制浓度（MIC）药剂的PDA培养基平板上，于25℃黑暗条件下继续倒置培养，能生长的视为抗药性突变体。对照药剂为甲霜灵，接种1 000个菌碟于含亚致死浓度甲霜灵的PDA培养基平板上。最后统计抗药性突变体的数量并计算抗性突变频率，突变频率按式（2）计算。

1.5 试验数据计算及分析

在Excel中计算各药剂处理浓度下的抑制率，使用SPSS计算辛菌胺对各菌株的毒力回归方程y=a＋bx、有效抑制中浓度EC50值以及95%置信限，同时也用SPSS20进行敏感性分布情况的分析。

2 结果与分析

2.1 FM-10对甲霜灵的敏感性测定

瓜果腐霉病菌FM-10对辛菌胺、甲霜灵的敏感性测定结果见表1。其EC50值分别为4.67、0.085μg/mL，说明该菌株对这几种药剂均表现敏感。此外，研究表明辛菌胺对瓜果腐霉病菌的MIC值均小于50 μg/mL，对甲霜灵的MIC值小于50μg/mL。

表1 瓜果腐霉病菌FM-10对辛菌胺、甲霜灵的敏感性

2.2 烟草猝倒病菌对辛菌胺的敏感性

经过组织分离和病原菌的鉴定，共分离到烟草猝倒病的病原瓜果腐霉菌株64株，其中有30株分离自云南省烟草病苗，34株分离自贵州省烟草病苗。通过菌丝生长速率法测定64株瓜果腐霉对辛菌胺的敏感性。结果表明，辛菌胺对64株瓜果腐霉的菌丝生长的最小抑制浓度（MIC）都小于50μg/mL，抑制效果比较好；辛菌胺对64株瓜果腐霉的EC50值分布为2.59～8.66μg/mL，平均EC50值为4.56±1.12 μg/mL，最大差异倍数为3.34倍；辛菌胺对64株瓜果腐霉菌的EC50值呈连续的单峰分布，经Kolmogorov-Smirnov检验P=0.20，该分布符合正态分布（图2）。由此可见，64株烟草猝倒病菌对辛菌胺均表现为敏感，且64株烟草猝倒病菌对辛菌胺的敏感性分布呈现正态分布曲线。

2.3 烟草猝倒病菌对辛菌胺的抗性风险评估

从敏感型菌株FM10的菌落边缘共打取了2 000个菌碟并接种在含亚致死浓度辛菌胺的PDA培养基平板上进行筛选。经过对含药板上菌丝生长的持续观察，在任一菌碟周围都没有出现扇形突变区域，即没有诱导到对辛菌胺产生抗性的菌株，抗性突变频率为0%，而作为对照药剂的甲霜灵，在接种于亚致死浓度PDA培养基平板上的1 000个菌碟中，共获得了136株对甲霜灵表现抗性菌株，抗性频率为13.6%（图3）。这一结果说明，烟草猝倒病菌对甲霜灵具有高抗性风险，而其对辛菌胺的抗性风险较低。

3 结果与讨论

本研究表明，辛菌胺对烟草猝倒病的病原菌，即瓜果腐霉具有较好的抑制活性，而且通过测定64株瓜果腐霉菌对辛菌胺的敏感性发现，64个菌株对辛菌胺都表现为敏感，且敏感性分布符合正态分布，说明本研究测定的64株瓜果腐霉对辛菌胺的敏感性分布情况可以作为敏感性基线使用。鉴于辛菌胺对烟草猝倒病菌的良好活性，EC50值为4.67μg/mL，说明辛菌胺在对烟草猝倒病的防治上具有较好的应用前景，可以将辛菌胺引入烟草病害的防控中，提高烟草病害尤其是烟草猝倒病的防控效率，同时该敏感性基线的建立也为日后田间烟草猝倒病菌对辛菌胺的敏感性监测提供了理论依据和数据支持。

甲霜灵是一种苯基酰胺类杀菌剂，在生产上常用来防治卵菌病害，目前已被国际杀菌剂抗性行动委员会（FRAC）列为高抗性风险杀菌剂[21-27]。笔者通过将引起烟草猝倒病的瓜果腐霉菌在含有亚致死浓度的甲霜灵PDA培养基平板上进行筛选，获得了突变频率为13.6%的抗性突变菌株，说明烟草猝倒病菌对甲霜灵具有较高的抗性风险。用同样的方法没有筛选到对辛菌胺有抗性的瓜果腐霉菌，说明其对辛菌胺具有很低的抗性风险。因此，对于已经产生抗药性尤其是对苯基酰胺类产生抗药性的植物病原物的防治，具有很大的应用潜力。同时辛菌胺与其他类型药剂混用对于延缓田间抗药性的产生也有重要的意义。