低温胁迫下外源激素对番茄SlMYB102转录因子表达量的影响

李梦丹，王美玲，郭仰东，张喜春

（1.北京农学院植物科学技术学院，北京 102206；2.中国农业大学园艺学院，北京 100193）

番茄（Solanum lycopersicum）是世界上最重要的蔬菜之一，由于其品种多样、营养丰富、用途广泛等优点，目前已经成为人们日常生活中最需要的蔬菜之一［1］。番茄是喜温植物，多数番茄品种在温度低于10℃时生长发育受阻，当温度低于6℃时表现明显的冷害症状［2］。冷害会破坏植物的细胞结构和功能，从而引起植株代谢失调、活性氧积累，进而破坏细胞生理和生化代谢过程，给其产量造成了较大的损失［3］。

当植物遇到低温胁迫时，为了适应胁迫带来的伤害，会激活一系列细胞反应和分子机制，从而导致多种植物基因表达的改变，这些基因的产物可以直接保护植物免受胁迫，或者进一步控制其他靶基因的表达。进而引起一系列的理化反应，建成一个信号调控网络，以提高植物对逆境胁迫的耐受性［4-7］。其中，在植物响应和抵抗环境胁迫的研究中，目前已经发现了很多重要的转录因子，主要包括MYB［8］、WRKY［9］、bZIP［10］、NAC［11］等转录因子。

转录因子（Transcription factor，TF），也称为反式作用因子，通常是指由基因编码的一类蛋白质，这些基因与基因启动子区域的相关顺式作用元件特异性结合，从而激活基因表达［12］。MYB类转录因子是重要的转录因子家族之一，根据MYB域的数量，MYB家族可分为四类，1R-、R2R3-、3R-和4R-MYB蛋白［13-16］。R2R3-MYB蛋白是植物特有的，是植物中最丰富的物种，在植物的基因组中大约有100多个R2R3-MYB成员，积极参与植物生长发育、次生代谢以及生物和非生物胁迫应答［17］。

目前，在番茄中MYB转录因子的功能研究主要集中在番茄果实成熟以及非生物胁迫方面。已有研究表明，低温、干旱和赤霉素等多种胁迫和激素可以诱导SlMYB113的表达，SlMYB113的过表达能够增加花青素的积累，进而提高转基因番茄的低温耐受性［18］；在对番茄R2R3-MYB家族的51个基因做表达分析时，其中响应NaCl处理的基因有10个，响应ABA处理的基因有11个，响应低温胁迫的基因有14个，说明番茄R2R3类MYB转录因子积极参与植物的非生物胁迫响应［19］。因此，转录因子与激素相互作用的机制和转录因子表达调控所依赖的途径和所发挥的作用各不相同。

在前期MYB102基因研究中发现，该基因启动子序列包含的顺式作用元件中，大部分与逆境或激素响应等相关，还有光反应元件以及细胞分化和分生组织生长相关元件。其中，响应的逆境类型包括8个，响应相关激素类型包括2个生长素相关元件、4个脱落酸相关元件和1个水杨酸相关元件［20］。以此为基础，本研究以番茄幼苗为试验材料，通过喷施SA、IAA、GA3、6-BA、ABA、MeJA 6种外源激素，研究其对番茄转录因子SlMYB102基因表达量的影响，进而了解6种外源激素对SlMYB102转录因子应答低温胁迫的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料及取样

以实验室自存俄罗斯栽培番茄品种Bolgogragsky（实验室种质编号25）为材料。将番茄种子暗培养3～5 d催芽后播种育苗，并置于25/20℃（16/8 h，60%湿度，光照12 000 lx）的光照培养箱中培养。三叶一心时分苗至10 cm×10 cm营养钵中，进行常规培养。当幼苗长至四叶一心时进行外源激素处理试验，外源激素采用SA（500μmol/L）、MeJA（100μmol/L）、GA3（400μmol/L）、ABA（100μmol/L）、IAA（100μmol/L）、6-BA（300 mg/L），以喷施去离子水作为对照处理。喷施过程中，叶正、背面均喷施，以表面附着一层液珠为准。每隔2 d喷施1次，共喷施3次。经激素处理的番茄幼苗置于4℃恒温培养箱中，分别在低温处理0、1、3、6、9、12、24 h时取番茄叶片于液氮中，并保存在超低温冰箱中，用于后续基因表达量的检测。试验至少进行3个生物学重复。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取与cDNA的合成 RNA提取采用Trizol试剂提取法。RNA提取后进行浓度和质量检测，将良好的RNA样品放于-80℃冰箱保存，用于后续试验。利用全式金的反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，具体方法参照说明书。

1.2.2 实时荧光定量PCR 根据SlMYB102基因和内参基因Actin序列，设计荧光定量PCR引物（qRTPCR F：TGGTCTGCTATTGCTGCACG；qRT-PCR R：CGTGGACTGTGTGTCACTGG）。反应体系见表1，反应程序见表2，基因的相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。

表1 qRT-PCR反应体系

表2 qRT-PCR反应程序

利用TB Green Fast q PCR Mix在Step One Plus Real-Time PCR System（Thermo Fisher）上运行反应，循环40次。

1.3 数据处理

试验数据处理采用2010版Microsoft Excel进行处理，数据的方差分析与显著性测试采用SPSS26.0软件进行，采用单因素方差分析（ANOVA）进行数据比较，利用Duncan’s新复极差法检验处理间差异的显著性水平，并在P＜0.05水平上进行检验。

2 结果与分析

如图1所示，在MeJA、GA3、IAA 3种激素处理下，SlMYB102基因的相对表达水平在1 h都出现上调，其中MeJA处理下上调倍数较高，高达8倍左右。随时间延长，在MeJA、GA3、IAA 3种激素处理下，SlMYB102的表达水平下降，在6 h又迅速上调，上调倍数达到最高，分别高达15倍、10倍和5倍左右，随后下调，在IAA处理下，24 h又出现了上调趋势；而在6-BA和ABA 2种激素处理下，SlMYB102的基因相对表达水平在9 h达到最高，分别为3倍和8倍左右，随后下降；在SA处理下，SlMYB102基因的相对表达量在9 h出现显著上调，高达14倍，随后下降，在24 h显著上调，高达38倍。

图1 SlMYB102基因在不同激素处理下的表达模式分析

3 讨论

低温冷害每年给蔬菜作物造成严重的危害，已有很多方法用来提高蔬菜作物的耐低温能力，最直接的改善番茄对低温抗性是选育耐低温的新品种［21］。解决番茄低温胁迫的最方便的是通过分子生物学技术将与抗寒性相关的基因转入栽培的番茄品种中，或者提高番茄植株体内与抗寒相关基因的表达量来提高番茄品种的抗寒性。这种方法既可以避免优良基因的丢失，又可挖掘植物体内与抗寒相关的功能基因，为今后的番茄抗寒性育种提供理论支撑［22］。

植物对于非生物胁迫的抵抗能力与转录因子的调节功能密切相关。在植物进化过程中，MYB转录因子的功能也变得更加多样化。MYB转录因子普遍分布于植物中，基本涉及植物生长和代谢的所有过程［23］。研究已发现非生物胁迫（如低温、干旱等）能诱导植物体内R2R3-MYB转录因子的表达，进一步直接影响或者间接调控一些抗性相关基因的表达，启动防御机制抵抗外界不良环境［24］。在本研究中番茄SlMYB102基因是MYB家族中R2R3-MYB类转录因子，已有研究表明，番茄SlMYB102受NaCl、ABA以及低温3种非生物胁迫诱导，在3种胁迫诱导下，SlMYB102基因表达量都会上升［25，26］。在转录因子的启动子中存在多种作用元件，非生物胁迫诱导启动子顺式作用元件与转录因子相互作用，在分子水平上调节植物对非生物胁迫的抗性［27］。而本试验研究的SlMYB102启动子的作用元件包括多种与激素相关的元件。

激素在植物抗寒调控网络中也发挥了重要作用。比如外源ABA可以提高甘蔗的抗寒性，外源ABA、GA3和6-BA对冬小麦的抗寒性有所帮助，茉莉酸甲酯处理对青椒冷藏过程中膜脂代谢影响的研究表明，MeJA可改善青椒的冷害状况等［28-30］。本试验结果表明，在ABA、GA3、IAA、SA、6-BA、MeJA 6种植物激素的诱导下，SlMYB102基因对于6种不同激素均有响应，并呈上调表达模式，并且此结果与启动子顺式作用元件分析相符合，SlMYB102作为MYB转录因子R2R3-MYB亚家族的基因，推测SlMYB102基因可能也参与到激素对植物抗寒的调控通路上。有研究克隆了R2R3类型MYB转录因子AtMYB15发现，该基因受低温诱导表达，可同ICE1互作并与CBF基因启动子区域的MYB顺式元件结合，从而提高拟南芥植株抗寒性［31］。紫甘蓝遭受低温胁迫时可以通过基因BoPAP1的急速上调来促进花青素的合成从而抵御寒冷［32］。还有研究表明，ABA、GA都参与到了植物生长发育和对非生物胁迫的适应性反应中［33］。在葡萄休眠芽中外源施用ABA可提高CBF/DREB1转录因子VvCBF2、VvCBF3、VvCBF4和VvCBF6的表达［34］。

目前，MYB转录因子与激素之间的研究较少。尤其MYB类转录因子中作为与抗性有关的一类基因，在将来的研究中可以将其与环境胁迫相关的植物激素相结合，进行更深入的研究。