淹水对金叶冬青叶片色差及生理生化指标的影响

周余华，顾敏敏

（江苏农林职业技术学院，江苏 镇江 212400）

金叶冬青（Ilex cornuta‘Oigon’）是冬青属常绿小灌木，单叶互生，叶缘疏生小刺。一年四季叶片都保持金黄色，适用于花园、广场和其他绿化区域内种植。金叶冬青作为新推出的一个花园观叶植物品种，耐寒，也很耐修剪。可以修剪成球状、塔状、层状等特殊造型，在造景方面可以和其他植物相配置，可丛植或孤植，是具有良好发展前景的常绿彩叶植物［1］。

被发现和引进的冬青属植物品种在中国就有四分之一左右。对中国来说，关于其药用价值的学术研究是冬青属植物现阶段的主要方向［2］。即使近年来植物界对冬青属植物的园林应用价值方面较为关注，但是其不足之处还有很多。例如，对于能够科学并合理地进行园林应用的植物品种，只有冬青、豆瓣冬青等几个少数品种，与国外相比较，对冬青属植物的研究远远不够［3］。

近年来城市园林的发展比较乐观，但是恶劣的环境条件是由来已久的问题，对园林植物的影响很大。对全人类来说，最具破坏力的自然灾害中就包括洪涝灾害。据联合国粮农组织和国际土壤学协会绘制的世界土壤图，全球约12%的土壤常年处于过湿状态［4］。目前，关于其他植物的水胁迫研究比较多，而与金叶冬青淹水胁迫有关的研究报道较少。任贵军［5］研究表明，淹水胁迫下银杏叶片的叶绿素含量不断降低，Fo明显上升，Fm、Fv/Fm、Fv/Fo均表现为显著降低的趋势；蔡金峰［6］研究发现，涝渍胁迫下，乌桕叶片的MDA含量随淹水时间的持续而逐渐增加。彭秀等［7］、王义强等［8］在淹水条件下，分别对中华蚊母、银杏的研究表明，可溶性总糖的含量在试验前期呈现出上升的趋势，但是试验后期却处于下降的状态。本试验试图在淹水胁迫条件下，对金叶冬青的色差及生理特性进行研究，以期为深入研究金叶冬青的耐涝性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与处理

试验材料为金叶冬青。选取生长旺盛、长势一致的二年生金叶冬青扦插幼苗30株，共3组重复，移至带托盘的花盆中（花盆直径22 cm、高19 cm）。胁迫处理前维持金叶冬青正常生长。

2018年10月7日起开始进行试验，设置淹水的水面位于根颈2 cm。淹水处理采用“双套盆法”［9］，即在塑料桶内放入栽有二年生金叶冬青扦插苗的花盆，定期续水，保证2 cm的淹水深度。测定时间为中午12：00，每隔5 d一次，直到叶片无法采样为止。选取生长点下第3～5片叶进行相关指标的测定，同时采集植株中上部的叶片，快速放置于有冰块的保鲜箱内，并迅速送到超低温冰箱内保存，用于测定渗透调节物质和丙二醛的含量，样品袋上需做好相应的标记。当天测定数据及时导出，并做好备份工作。试验区位于通风、光照良好的开阔场地，设置雨棚，防止淋雨对试验造成影响。

仪器：梅特勒ML204型万分之一天平；美国MD SpectraMax 190波长酶标仪。

1.2 测定指标与方法

1.2.1 叶片色差测定 选用CM-700 d/600 d分光测色计，第一次测出的数据作为标准色，之后的数据则为对比色，主要测定△L、△a、△b、△Eab等指标。

1.2.2 叶片荧光测定 选用Handy PEA高速连续激发式荧光仪对叶绿素的荧光参数进行测定。对待测的金叶冬青叶片进行30 min的暗反应后，测出Fo、Fm、Fv/Fm以及Fv/Fo等指标的值。

1.2.3 叶片光谱测定 选用Unispec-SC型光谱分析仪，测定R640、R700和R800等参数值，依据叶片反射指标来计算叶绿素的含量。

1.2.4 叶片可溶性糖、可溶性蛋白质含量的测定可溶性糖含量测定采用蒽酮法［10］，可溶性蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法［11，12］。

1.2.5 叶片丙二醛（MDA）含量的测定 试剂盒法测定MDA含量［13］。

1.3 数据统计与处理

运用Excel进行数据统计与分析。

2 结果与分析

2.1 淹水对金叶冬青叶片色差的影响

金叶冬青在淹水条件下，由于试验时间的延长，植株叶片的色彩会发生明显的变化。从图1可以看出，随着金叶冬青淹水胁迫时间的延长，叶片的颜色由最初的金黄色渐渐变红，最后至红褐色。从第1天到第23天期间，叶片的色彩逐渐变深，但是在第39天之后植株的叶色变化没有之前明显。

图1 淹水胁迫下叶片色彩的变化

Lab色能够感知并测量任何颜色，亦可以利用△L、△a、△b和△Eab来对标准样与测试样的色差进行表示：如果△L的值为正，则表示测试样的颜色比标准样的颜色要浅或白，为负则表示叶片颜色偏深或黑。如果△a的值为正，则测试样的颜色比标准样的颜色要红，为负则表示叶片的颜色偏绿；如果△b为正，则测试样的颜色比标准样的颜色要黄，为负则叶片的颜色偏蓝；△Eab代表的是总色差，可以作为一个指标用于色差的评定，它的值越大，说明叶片的色差越大，反之则表示叶片的色差越小［14］。

从图2可以看出，△L、△a、△b三者的值在10月17日（第11天）前变化很小，说明在这11 d内，金叶冬青对淹水较适应；从第11天后到10月29日（第23天）间急剧变化，说明淹水已经对金叶冬青产生明显的影响，在这12 d中，金叶冬青叶色上的变化表明淹水已经影响到金叶冬青正常的生理活动；第23天之后，金叶冬青的叶色再次趋于稳定，说明金叶冬青已经处于淹水的伤害之中。

图2 淹水胁迫下△L、△a、△b的变化

△a的变化：淹水胁迫对△a的影响总体上不大，并且变化相对平缓。△a的值始终大于0，表明随淹水时间的延长，金叶冬青的叶片逐渐变红。且第17天的△a的值是第11天的6倍多，在第23天之前淹水条件对金叶冬青的影响较大，而之后△a的值趋于平缓。

△L、△b的变化：淹水胁迫对△L、△b的影响较大，第23天之后变化幅度较小。△L、△b总体上均为负增长，表明随淹水时间的延长，叶片颜色偏黑和偏蓝。第6天均为负值，第11天均变为正值，之后又均变为负值，且不断负增长，第11天至第23天变化极为明显，分别降低了9.5、8.3倍。

△Eab的变化：从图3可以看出，随淹水时间的延长，金叶冬青叶片的总色差△Eab变化很明显，呈直线上升趋势。第11天到第23天之间的3次色差测定，总色差的值直线上升，增加了6.3倍，可能是金叶冬青苗木受到淹水胁迫的影响，从而表现出叶片色彩的变化。第23天之后，叶片总色差变化总体上呈波浪起伏，相对缓慢地增加。

图3 淹水胁迫下总色差△Eab的变化

2.2 淹水对金叶冬青叶片荧光特性的影响

2.2.1 淹水对金叶冬青叶片Fo、Fm的影响 当PSⅡ反应中心在完全开放的状态下的荧光产量，称作为初始荧光，即Fo，亦称为基础荧光；而当PSⅡ反应中心在完全关闭的状态下的荧光产量，可以称为最大荧光，即Fm［15］。

从图4可以看出，在试验次数增加的情况下，金叶冬青叶片的初始荧光Fo总体上呈现大幅下降的趋势。至第23天其Fo降低了58.6%，表明金叶冬青对淹水胁迫较敏感，但是之后其Fo反而略上升，说明金叶冬青通过自身的调节，减少了淹水胁迫对PSⅡ的破坏程度。而金叶冬青的最大荧光Fm呈下降的趋势，至第23天Fm的值变化显著，下降了75.8%，第23天之后则呈相对平稳不变的状态。

图4 淹水胁迫下初始荧光Fo、最大荧光Fm的变化

第23天后Fm与Fo的值趋于接近的状态，且随试验时间的延长两个参数的值更加接近，表明PSⅡ反应中心完全开放和关闭时的荧光产量几乎相同，其受到了明显的破坏，而金叶冬青所受到的影响较明显。

2.2.2 淹水对金叶冬青叶片Fv/Fo、Fv/Fm的影响 Fv/Fo可以作为胁迫条件测定光化学反应状况的一项重要的测试指标。Fv/Fm对金叶冬青的叶片来说，在光合作用的利用方面起着决定性的作用，这两个参数值对研究金叶冬青所受到淹水胁迫的影响是否显著很重要［16-18］。

由图5可知，第1天至第34天（11月9日），Fv/Fo与Fv/Fm的值呈直线下降趋势，分别降低了86.5%、75.1%，表明淹水条件对金叶冬青的生长产生了很大的影响。同时，淹水胁迫下金叶冬青的PSⅡ反应中心产生不可逆转的损伤，妨碍了叶片的光合过程。第34天之后，二者的值均明显提高。第44天到第49天，两个参数的值分别上升了6.9、3.2倍；第49天至第54天，两个参数的值分别下降了79%、63%。出现这种情况可能是因为受到天气情况的影响，其他测定时期所得到Fv/Fo、Fv/Fm的值均趋于平稳且波动幅度不大，但是两个指标都达到了最小值，说明虽然金叶冬青对淹水胁迫产生了耐受性，但是反应中心受到了比较严重的破坏。

2.3 淹水对金叶冬青叶绿素含量的影响

对于植物来说，有一种为其生长、开花结实等生命周期提供所需营养的物质，就是叶绿素。植株叶片的光合作用强度能够用叶绿素的含量来反映。

图6中，参数R800/R640和R800/R700的值与叶绿素含量呈正相关。因此，可以清晰地看出在整个试验过程中，大多次试验中叶绿素含量的变化是处于平缓、略增加的状态，叶绿素含量的变化不明显，说明一定的淹水条件能够使叶绿素含量增加，光合作用增强。但是，第28天和第67天测定的数据高于其他次的试验数据，第23天R800/R640的值分别上升和下降了76.3%、37.2%，R800/R700的值分别上升和下降了36.4%、26.2%；第60天R800/R640的值分别上升和下降了33.7%、33.4%，R800/R700的值分别上升和下降了37.5%、30.4%。第28天和第67天这两次测定中，出现这种突然增加的情况的原因可能是，气候条件或天气状况等不确定因素，不利于金叶冬青的生长，此外水胁迫对其生长状况亦造成不良的影响，金叶冬青为抵抗种种不良因素，使得叶绿素含量显著增加。

图6 淹水胁迫下R800/R640、R800/R700的变化

2.4 淹水对金叶冬青叶片可溶性糖和可溶性蛋白质含量的影响

可溶性糖是重要的渗透调节物质，易受淹水胁迫的影响，植物为了适应恶劣的环境会积累可溶性糖，且为植物提供能量，可以减轻植株所受到的伤害；蛋白质对植物来说是重要的结构和功能物质。淹水条件下会影响植物蛋白质的合成，所以它能够反映植物在逆境中所受的伤害程度；二者均通过渗透调节，降低水势，维持细胞的正常代谢［19，20］。

由图7可知，金叶冬青在淹水胁迫下，由于试验次数的增加，金叶冬青叶片可溶性糖含量呈缓慢上升的趋势，表现为升、降的规律性变化。第1天至第6天可溶性糖的变化较明显，升高了46.1%，第11天至第84天仅增加了20%，增长较为平缓。由此说明，淹水胁迫对可溶性糖含量具有一定的积累作用，这也是适应淹水胁迫的结果。

图7 淹水胁迫下可溶性糖的含量变化

图8表明，金叶冬青叶片可溶性蛋白质含量的变化表现为升、降的规律性变化，大致呈上升趋势。但是其蛋白质含量时低时高，第60 d与第67 d相比下降了32%。因此，淹水胁迫的环境条件对金叶冬青叶片产生了严重的影响，增加了金叶冬青叶片蛋白质的合成。

图8 淹水胁迫下可溶性蛋白质的含量变化

2.5 淹水对金叶冬青叶片丙二醛（MDA）含量的影响

MDA是膜脂过氧化的重要产物，能够反映膜脂过氧化的程度。对于植物来说，衡量植株受损害程度的一个极为重要的指标，就是植物体内丙二醛的含量，对研究淹水胁迫有重要的意义［21］。

由于所受到的淹水时间延长，金叶冬青叶片的MDA含量在不断变化。由图9可以看出，第1天至第60天的试验过程中，MDA的含量呈波动上升，波动幅度比较稳定。第72天至第84天，MDA的含量波动较大。第72天至第78天，MDA的含量增加了47.5%；第78天至第84天，则下降了42.6%，上升以及下降的幅度很大。因此，金叶冬青在前12次的试验过程中，MDA的含量变化波动不大，表明金叶冬青受到了涝渍环境的影响，使MDA的含量有规律的增加，且这种影响是在忍受范围内的。第67天测定之后，MDA含量波动挺大，可能是由于金叶冬青为了抵御淹水条件，产生的消极影响比较强烈。

图9 淹水胁迫下MDA含量的变化

3 小结与讨论

金叶冬青淹水胁迫采用“双套盆法”，分析淹水胁迫下二年生金叶冬青的叶片色差、叶绿素含量、荧光特性、渗透调节物质以及丙二醛等相关指标的变化。通过84 d的淹水胁迫，随着胁迫不断持续，金叶冬青叶片的颜色变暗，叶片的Fo、Fm值、Fv/Fo与Fv/Fm的值呈现直线下降的趋势，直到10月29日（第23天），此后各值趋于平稳。说明在第23天前，淹水胁迫对金叶冬青叶片的形态色泽、叶片生理因子的影响产生剧烈的变化，此时期内，金叶冬青受到淹水的影响，植株生活力不断降低。可溶性糖、可溶性蛋白质和MDA含量在整个试验过程中，整体呈上升趋势；可溶性糖、可溶性蛋白质在前6 d内不断增加，表明植株不断积极抵消淹水胁迫的不良影响，金叶冬青能够对淹水胁迫的环境作出响应并能进行自我调节；MDA含量在10月29日（第23天）前总体平稳变化，之后则有较明显的上升趋势，说明随淹水胁迫的不断持续，对金叶冬青的伤害也愈趋明显。叶绿素的含量处于平缓的增加状态，表示一定的淹水条件能够使叶绿素含量增加。

综上，金叶冬青叶片的色差和各个相关生理指标，在淹水条件下受到显著影响，并且由于淹水胁迫的持续进行，金叶冬青所受到的损伤处于不断加重的状态。但是，金叶冬青经过84 d的试验，依旧处于存活的状态，且淹水180 d后，成活率为20%。因此，金叶冬青作为城市园林绿化新引进的彩叶树种，有一定的耐涝能力，可以适应较长时间的淹水胁迫，然而长时间的淹水会对其生长会造成严重的抑制作用。

淹水胁迫通常会使植物叶片的叶绿素含量降低，例如不结球白菜的叶绿素含量明显下降［22］。然而有一些植物在淹水条件下却增强了叶绿素的合成，使得叶绿素的含量增加，即淹水胁迫条件并不会减少植物叶片光合色素的含量［23］。在丁香［24］、烟草［25］的研究中，这两种植物叶绿素的含量明显上升，MDA含量显著增加，可溶性糖的含量因为试验的时间变长而增加，本研究的结果与该结果相符合。

由于本试验处于相对理想的环境条件，金叶冬青的耐涝性可能会随着外界环境条件的变化而发生改变，例如温度的升高或下降、光照的强弱。本试验中，对于叶绿素含量并不是通过试验提取的方式获得，仅仅通过计算的方式绘制出其变化趋势，非具体的数据可能存在偏差；且没有测花青素的含量，该指标对色差的数据分析很重要。Perata等［26］首次在洪水研究中利用拟南芥抗洪性的自然变异，有趣的是，拟南芥的抗洪性与水分胁迫下的叶柄生长呈负相关，但与淀粉和可溶性糖的初始量无关。本试验对于苗木的叶柄、根径和株高等相关指标未进行测定，淹水胁迫可能对其产生一定的影响。以上情况对试验的结果有着直接的影响，可能会带来耐涝性的差异，试验结果需要进一步验证。