芹菜素对深II度烧伤创面愈合的影响及机制研究

许冈跃，陈 骅

(中国人民武装警察部队海警总队医院外三科·浙江 嘉兴 314000)

烧伤发生率居外伤疾病谱第4位，具有较高的致残、致死率。根据烧伤程度及深度可分为I度、浅II度、深II度和III度烧伤，临床上深II度烧伤最为常见且治疗结局变数较大,促进皮肤烧伤创面愈合是烧伤治疗的关键。病理生理学研究发现，创面局部氧供不足而诱发氧化应激反应是影响创面愈合的关键因素[1-2]。芹菜素(apigenin，APG)是广泛存在于蔬菜和水果中的一种黄酮类化合物，以芹菜中含量最高，具有良好的抗氧化、抗炎、抗凋亡活性[3-5]。本实验将通过制备深II度烧伤大鼠模型，观察APG对深II度烧伤创面愈合的影响并探讨其可能的作用机制。

1 材料

1.1 实验动物 150只SPF级健康雄性SD大鼠，7 周龄，体质量200～240 g，购自河北省实验动物中心，许可证号：SCXK(冀)2018-004。实验前适应性饲养1周，饲养环境：室温(25±1)℃、相对湿度(60±5)%、光照黑暗各12 h交替。

1.2 药物与主要试剂 APG：陕西慧科植物开发有限公司，纯度≥98%，加二甲基亚砜溶解后通过生理盐水定容，制备浓度6.25、12.50、25.00 g/L的芹菜素溶液；乳酸钠林格注射液：石家庄四药有限公司。羟脯氨酸(HYP)试剂盒：南京建成生物工程研究所；表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞因子(b-FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)抗体和DAB显色试剂盒：北京博奥森生物科技有限公司。

1.3 主要仪器 YLS-5Q型烫伤仪：天津科技发展有限公司；TDL-80-2B型台式离心机：上海安亭科学仪器厂；UV2100型紫外-可见分光光度计：北京瑞利分析仪器有限公司； VE180型小型电泳槽、VE186型转膜槽：上海天能科技有限公司；CFX型凝胶成像系统：美国Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 动物分组、模型制备与给药 将150只大鼠进行数字编码后按照随机数字表法分为假烧伤组，模型组，APG低、中、高剂量[10、20、40 mg/(kg·d)]组，各30只；实验前12 h禁食禁水。深II度烧伤大鼠模型制备[6]：实施麻醉，剃除背部毛发后通过硫化钠溶液(浓度8%)脱毛，根据公式S=K·W2/3[S为体表面积(cm2)、W为体质量(g)、K=0.091]计算体表面积[7]；假烧伤组大鼠脱毛后即腹腔注射5 mL乳酸钠林格溶液，其余各组大鼠通过烫伤仪于背部脱毛处皮肤加压0.03 MPa、温度106 ℃持续5 s制备深II 度30%烧伤大鼠模型，然后立即腹腔注射5 mL乳酸钠林格溶液以抗休克。造模结局判断：皮肤创面组织病理切片，部分真皮层内细胞坏死、部分毛囊、汗腺等附件结构完整，即可判定造模成功。造模完成后，APG低、中、高剂量组分别腹腔注射浓度6.25、12.50、25.00 g/L的芹菜素溶液(注射剂量2 mL/kg)，假烧伤组和模型组大鼠2 mL/kg同步给予生理盐水，1次/d，连续给药14 d。

2.2 观察指标及测定

2.2.1 烧伤创面恢复状况观察、愈合率检测及含水量计算 各组按随机数字表法随机取10只大鼠，观察各组大鼠皮肤创面恢复状况，包括皮肤颜色、毛发生长状况、结痂状况、渗出液量等。分别于第0天、第14天对创面进行拍照，通过图像分析系统计算创面面积，创面愈合率(%)=(1-未愈创面面积/初始创面面积)×100%。颈椎脱臼处死大鼠后，取皮肤创面组织，生理盐水冲洗并拭干后称重(W1)，置95 ℃烤箱烘烤至恒重后称重(W2)，含水量(%)= [(W1- W2)/W1]×100%

2.2.2 创面组织HYP含量检测 分别取各组剩余的10只大鼠，颈椎脱臼处死后取皮肤创面组织，剪碎、加入9倍量4 ℃裂解液后研磨匀浆，4 ℃、3 500 r/min离心10 min后取上清液，按照各试剂盒操作说明，通过紫外—可见分光光度计检测HYP含量。

2.2.3 创面组织EGF、b-FGF、VEGF蛋白表达检测 Western blot检测。取各组大鼠创面组织匀浆液，4 ℃、12 000 r/min离心20 min后取上清液，BCA法检测样品蛋白浓度后95 ℃水浴10 min使蛋白变性，取30 μg蛋白量行SDS-PAGE电泳使蛋白分离、转PVDF膜、5%脱脂奶粉溶液室温封闭1 h后滴加EGF、b-FGF、VEGF、β-actin一抗后4℃孵育过夜，洗膜后滴加二抗室温孵育1 h，洗膜后滴加DAB显色，以β-actin为内参，通过凝胶成像系统以条带灰度值半定量目标蛋白表达量。

3 结果

3.1 APG对深II度烧伤大鼠创面恢复的影响 假烧伤组大鼠创面呈正常皮肤颜色、毛发生长茂密。模型组创面结痂厚度不均、少部分脱落，可见黄色液体渗出，可见少量新生肉芽。与模型组比较，APG低、中、高剂量组创面面积减小、大部分结痂脱落、新愈合皮肤红润、创面区域毛发开始生长、液体渗出量减少。APG高剂量组新愈合皮肤较红润且弹性较好、毛发生长较茂密、未见液体渗出，效果优于其它组。

3.2 APG对深II度烧伤大鼠创面愈合率和含水量的影响 见表1。

表1 各组大鼠创面愈合率和含水量的比较

3.3 APG对深II度烧伤大鼠创面组织HYP含量的影响 见表2。

表2 各组大鼠创面组织HYP含量的比较

3.4 APG对深II度烧伤大鼠创面组织EGF、b-FGF、VEGF蛋白表达的影响 见图1，表3。

A.假烧伤组；B.模型组；C.APG低剂量组；D.APG中剂量组；E.APG高剂量组图1 各组大鼠创面组织EGF、b-FGF、VEGF蛋白表达的Western blot 检测结果

表3 各组大鼠创面组织EGF、b-FGF、VEGF蛋白表达的比较

与假烧伤组比较，模型组大鼠创面组织EGF、b-FGF、VEGF蛋白表达量显著升高(P<0.05或P<0.01)；与模型组比较，APG低、中、高剂量组EGF、VEGF蛋白表达量显著升高(P<0.01)，其中APG中、高剂量组b-FGF蛋白表达量显著升高(P<0.01)。

4 讨论

皮肤是最易受烧伤损害的体表组织，根据“三度四分法”分级，临床上以深II度烧伤较为多见，其烧伤深度达真皮网层，但仍有部分真皮组织及毛囊、汗腺等皮肤附件存活，烧伤创面处理不当可能诱发感染，导致创面加深、迁延不愈，增加治疗难度甚至致死，因此良好的创面治疗效果是提高深II度烧伤患者预后的关键[8-10]。

黄酮类化合物能够通过抑制烧伤创面渗出物而促进创面愈合[11]。APG是天然存在的一种黄酮类化合物，以芹菜中含量最高。本研究发现，经APG给药14 d能够有效促进大鼠创面皮肤、毛发新生，保护毛囊、汗腺等皮肤附件，减少渗出液体量；提高创面愈合率，改善创面组织病理性形态结构改变；提示APG具有促进深II度烧伤创面愈合的作用。

HYP是胶原含量检测的标志物，创面组织HYP水平能够反映创面愈合状况[12]。本研究发现，经APG给药14 d能够有效降低创面组织含水量并提高HYP水平，也说明APG具有促进深II度烧伤创面愈合的作用。

EGF和b-FGF是两种多肽类物质，其中EGF具有促进表皮角质细胞和纤维细胞增殖和分化、促进血管新生作用[13-15]；b-FGF具有促进细胞增殖和迁移作用[16]；卫昊等[17]研究发现上调EGF、b-FGF表达能够明显促进烧伤创面愈合。VEGF具有促进血管内皮细胞增殖作用，进而促进血管新生[18-20]。本研究发现，经APG给药14 d能够明显上调创面组织EGF、b-FGF、VEGF蛋白表达。

综上所述，APG具有促进深II度烧伤大鼠创面愈合的作用，作用机制可能与上调EGF、b-FGF、VEGF蛋白表达有关。