桑叶中1-脱氧野尻霉素研究进展

谢克英 娄芳慧 孙瑞琳 钱志伟

关键词：桑叶;1-脱氧野尻霉素;生产工艺;研究进展

桑树属于桑科植物桑属，桑叶性寒、味甘苦，具有疏风散热、润肺祛燥、清肝明目的功效，古医药著作《神农本草经》称其为神仙叶。现代医学表明，桑叶中含有丰富的营养成分和生物活性物质，桑叶作为中药材已被国家药典正式收录，是卫生部批准的药、食两用宝贵资源[1]。现有研究报道从桑叶中提取的生物碱，尤其是多羟基生物碱1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，1-DNJ） 具有良好的降血糖、降血脂和抗氧化等作用[2]。

一、1-DNJ的来源

日本Yoshiaki等人在1976年首次从桑根皮中分离提纯得到1-DNJ[3]。桑树各个器官均含有1-DNJ，但其含量因品种、栽培区域以及树体药用部位不同存在差异。对桑叶来说，叶位、发育阶段、采收时间和季节这些因素都对1-DNJ 含量有影响。1-DNJ 来源于植物和微生物[4]，除桑树外，野跖草、风信子、沙参属植物也含有1-DNJ及其类似物，但其含量均低于桑树;微生物发酵产生的1-DNJ含量更低，在0.01mg/mL左右。

二、1-DNJ的药理学功能

1-DNJ的结构与α-1，4-葡萄糖近似，在机体内与葡萄糖竞争酶上的催化位点。1-DNJ不仅能够调节餐后血糖水平异常升高，亦可改善糖尿病常见并发症。降低食物中碳水化合物分解速率，抑制餐后血糖升高，减少葡萄糖摄入的关键是抑制α-葡萄糖苷酶活性[5]。1-DNJ可以促进B细胞分泌胰岛素，从而起到降血糖的效果。糖尿病小鼠的血糖、血甘油三酯水平在1-DNJ作用下显著降低，提高小鼠肝脏的葡萄糖代谢酶活力和蛋白质表达水平，从而提高动物的脂联素水平，激活β-氧化系统，抑制肝脏脂质积累。利用糖尿病小鼠开展的降糖机理研究表明，1-DNJ可以降低肠道对葡萄糖吸收，调节参与糖转运、糖酵解及糖异生代谢过程的酶，有利于肝内葡萄糖代谢，血糖浓度得以降低。李有贵等[6]研究表明桑叶辅助降血脂活性，桑叶总生物碱对高脂饲料造模的SD大鼠的血清总胆固醇降低达35.3%，高密度脂蛋白胆固醇提升达27.53%，降血脂活性明显。王辉等[7]研究的20个品种桑叶浸提液均具有抗病毒活性，不同病毒的活性抑制具有一定的选择性，推测桑叶1-DNJ为病毒抑制的主要活性成分。陈玉华[6]对1-DNJ抗肿瘤活性研究试验表明，1-DNJ能够抑制人胰腺癌裸鼠皮下移植瘤的生长，1-DNJ能调节胰腺癌SW1990细胞的生长周期。

三、1-DNJ的提取与纯化

（一） 1-DNJ的提取

关于桑叶中1-DNJ的提取，已有的报道中多是采用水提取法、有机溶剂提取法和酸提取法。1-DNJ存在于细胞内，且溶于水。1-DNJ提取时需要先破坏细胞壁等细胞结构，因此微波、超声等辅助手段有利于1-DNJ的提取。

微波辅助萃取是微波萃取与传统溶剂萃取相结合，通过偶极子在材料或溶剂中诱导分子运动，导致样品升温，利用加热使植物细胞蒸发失去水分;蒸汽产生膨胀，最终使细胞破裂并释放其活性成分的一种新的萃取技术。与传统萃取技术相比，该工艺具有萃取温度低、萃取次数少、无热惯性（易于控制）、效率高、溶剂用量少、操作成本低、工作空间小等优点。胡瑞君等[9]利用微波辅助萃取的方法提取桑叶中1-DNJ。此法1-DNJ的提取受微波处理时间、功率、固液比和提取次数这些因素的影响，优化后的最佳提取工艺1-DNJ的提取率为0.024%，其中微波处理时间为1.5min，功率为406W，固液比为1∶40，提取次数为2次。

超声辅助萃取是一种利用声波在样本组织附近产生空化气泡，并通过空化气泡破坏细胞壁和产生空穴，从而增加质量传递且释放细胞内容物，以达到在更短的时间内从不同基质中提取分析物的有效方法[10]。王璐等[11]采用响应面法优化超声细胞破碎机辅助低共熔溶剂提取桑叶1-DNJ，研究结果表明，氯化胆碱甘油和水组成低共熔溶剂提取效果最好，优化条件后1-DNJ的提取量为1.445mg/g，其中，氯化胆碱与甘油比例为1∶3.4，含水量40%，超声时间32min，重复3次。

超临界流体萃取是一种广泛应用于食品原料、补充剂和植物药剂等天然固体物质提取的方法，因其具有更高的安全性、更短的提取時间和更高的选择性而在提取生物碱等化合物上越来越受欢迎。

（二） 1-DNJ的纯化

1-DNJ的纯化，主要利用不同生物碱及其他次生代谢物分子量不同、吸附能力不同、键结合力不同，设计不同的层析柱或色谱柱进行1-DNJ的纯化。大孔树脂，特别是常用的吸附型和离子交换型，分别对应于非特异性物理吸附和离子交换的机理，在分离和纯化天然产物中应用较多[12]。祝上宾等[13]利用吸附树脂分离纯化桑叶中1-DNJ，并通过亚临界水法提取桑叶中的1-DNJ，对比了离子交换型树脂、吸附型树脂以及两种树脂联用纯化提取液中DNJ的效果。试验结果显示，吸附型树脂所得1-DNJ含量较原提取液提高2.9 倍，阳离子树脂所得1-DNJ 含量较原提取液提高3.8倍，联合使用两种树脂，所得1-DNJ含量较原提取液提高11.5倍。

从工艺复杂性来看，大孔树脂吸附法、硅胶柱层析法、高效液相色谱法的操作均十分复杂，涉及多个步骤，因此，其耗费的时间相对也比较长，处理量较大。大孔树脂吸附法与高速逆流色谱法使用的有机溶剂繁多，有些对人体健康和环境安全影响较大，故在食品与药物产品的加工方面应慎重使用。

原有的萃取技术大多需要使用挥发性有机溶剂，容易污染环境，近年来出现的浊点萃取法恰好解决了这些问题。金属螯合物、生物大分子等在分离与纯化及环境样品的前处理应用该法均已取得良好效果。液液分离过程中改变实验参数引发相分离，以浊点现象和中性表面活性剂胶束水溶液的溶解性作为分离基础，疏水性物质和亲水性物质得到分离[14]。Na Guo等[15]建立了浊点萃取富集桑叶样品中5种目标化合物（脱氧野尻霉素、绿原酸、芦丁、异槲皮苷和黄芪甲素） 的方法，最佳条件下，5个目标化合物优于常规溶剂提取。

离子液体具有低毒、低挥发性、环境友好，还具有可设计等特性，离子液体应用在固相微量萃取、含水两相萃取、液相微量萃取、分散相液液微量萃取、液液萃取等分离技术中以及核酸、氨基酸、蛋白质、農药残留、芳香族有机物、金属离子等的萃取、检测方面。国外已有大量报道，利用离子液体法及离子液体联用微波、超声波、酶、双水相等方法提取黄酮、生物碱、多酚、萜类等天然产物。

四、1-DNJ的检测

1-DNJ属于哌啶型生物碱，这类生物碱不含苯环、双键及羰基等发色团，紫外波长范围内光吸收低，无法用紫外检测器检测。除此之外，哌啶生物碱结构中含有多个羟基，分子极性较大，光度检测方法定性定量较困难。紫外分光光度法所用仪器相对简单，但由于受发色基团及其他有色物质干扰等问题存在检测灵敏度低的缺点。杨海霞等[16]采用分光光度法测定1-DNJ含量，在线性范围内先建立标准曲线，获得线性方程，获得较为精确的定量结果。龙玲等[17]利用铜离子作为掩蔽剂，1-DNJ与二硫化碳反应，有机溶剂萃取反应产物，440nm下测量产物吸光度，检测枯草芽孢杆菌变异菌株中1-DNJ 含量，探讨了这一方法的准确度、精密度、灵敏度以及产物的稳定性，找到了一种快速检测细菌发酵液中1-DNJ含量的方法。

色谱方法可以分离各种生物碱及其他有机物成分，根据衍生物化学特性配以不同的检测器对1-DNJ 进行检测，如，液相色谱法、离子色谱法和气相色谱法等。液相色谱一般用到柱前衍生的方法，衍生物与1-DNJ结合，形成发色团，荧光物质比紫外检测物质检测限更低。液相色谱还可以串联质谱，所测结果精确度更高[18]。气相色谱法具有分析时间短的优点，将1-DNJ衍生化成较低沸点的酯，稳定性得到提高，适用于大批量样品的定量分析[19]。高林森等[20]通过高效液相色谱——二极管阵列检测器法检测桑叶中的1-DNJ，在pH8.5 的硼酸盐缓冲液中用芴甲氧羰酰氯为衍生剂，采用酸提取方法，衍生物在紫外区有吸收峰，265nm有最大吸收波长，流动相为乙腈和水，C18色谱柱进行分离。试验结果证明，1-DNJ 得到分离，检出限、线性相关系数、样品加标回收率、相对标准偏差等结果非常理想。李名洁等[21]通过固相萃取——高效液相色谱法测定不同地域及季节桑叶中1-DNJ含量，检测器为蒸发光散射检测器，流动相为乙腈和醋酸铵水溶液，采用等度洗脱，试验结果证明：线性关系、平均回收率、相对标准偏差等结果好，方法简便、准确、重现性好。

喷雾质谱法可以快速、直接对样品中成分进行半定量分析，具有简单、高效的优点，在快速筛选中具有良好的应用前景。Ning Zhang等[22]采用叶面喷雾质谱法确定了桑树不同部位1-DNJ的相对含量，探讨了1-DNJ在桑树中的分布规律，该方法对利用桑树生产功能性或药用食品和药物开发具有一定的指导意义和参考价值。

研究展望

桑树是1-DNJ含量相对较高的物种之一，但对桑树中1-DNJ的开发研究才刚起步，在提取、纯化生产工艺研究等方面还需要深入进行。近年来，超临界流体萃取技术和离子液体纯化技术在其他药用植物方面应用颇为广泛，采用这些新技术提取和纯化桑叶生物碱值得研究。1-DNJ在降血糖、降血脂、抗病毒、抗肿瘤等方面具有很高的药用价值，更多的学者开始关注桑树的开发利用。充分发挥桑树的药用价值，对桑树产业发展和人类健康具有十分重要的意义。