茶叶抗癌作用机制的网络药理学分析

吴雨泉，杜紫微，李佳珍，王一硕,2*，石延榜,2

1.河南中医药大学，河南 郑州 450046；2.河南省中药生产一体化工程技术研究中心，河南 郑州 450046

克服癌症是人类面临的难题之一。据美国癌症研究协会（AACR）发布的2017年癌症进展报告指出[1]，至2035年全球每年癌症新发病例数可能增加至2400万例，这将给人们的生命健康及社会的经济负担带来严重的威胁。然而，有学者认为植物化学物对多种癌症有预防作用[2]，尚可通过日常饮食予以摄入。

中国茶文化历史悠久，品种众多，其养生保健作用深受广大消费者的喜爱。茶的药用价值最早记载于《神农本草经》，素有“神农尝百草，日遇七十二毒，得荼而解之”之说。目前，茶叶已涉及食品、药品和保健品等多个领域。现代研究发现，茶叶中主要富有茶多酚类[3]、生物碱[4]和氨基酸类等[5]化学成分。尽管茶叶对癌症的防治具有潜在的积极作用[6-8]，但涉及的潜在分子机制仍然不明晰。基于此，本文通过生物信息技术、多向药理学及网络分析等融为一体的网络药理学方法[9]，对茶叶中主要化学成分进行抗癌作用先验性探究，以期为揭示茶叶抗癌的科学内涵提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 茶叶成分与靶标的收集

通过知网文献，搜集茶叶中主要的化学成分；把所收集到的成分在化源网（www.chemsrc. com）数据库中确定其结构式，并使用Chembiodraw 软件手动画取，保存为“CDX”格式；将所有的化学结构式导入SwissTarget Prediction（www.sib.swiss）数据库，预测其作用靶点。

1.2 茶叶成分-靶点的网络构建与拓扑学分析

将上述获得的成分与靶点导入 Cytoscape 3.7.2软件，构建活性成分-靶点网络；利用“Analysis network”工具对该网络进行拓扑分析，以Degree值表示重要节点，其值越大，表明在网络中越重要。

1.3 茶叶成分-疾病的交集靶点分析

以“Cancer”为关键词，在Genecards和DrugBank 两个数据库中检索癌症的疾病靶点。其中，Genecards数据库的检索结果通过多次筛选“Relevance score”值的中位数，以获得相关度高的靶点信息。将两个数据库所搜集的信息合并，删除重复项后保存；再将成分靶点与疾病靶点导入Venn（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn）获得交集靶点。

1.4 PPI网络的构建与核心靶点筛选

通过String数据库（https://string-db.org）分析互作靶点。将物种选择“人类”并隐藏游离节点，其他参数保持默认值，构建PPI网络；利用Cytoscape 3.7.2 软件中进行可视化分析，并根据Degree值的中位数筛选核心靶点。

1.5 GO与KEGG富集分析

将[1.4]获得的核心靶点导入Metascape数据库（https://Metascape.org），物种选择“人类”，对其进行GO生物功能富集分析，包括生物过程（Biological process，BP）、细胞组成（Cell composition，CC）和分子功能（Molecular function，MF）；KEGG通路富集分析使用同一数据库。

2 结果与分析

2.1 茶叶成分与靶标的收集结果

通过文献研究[4,10-12]，最终纳入儿茶素（Catechin）、表儿茶素（Epicatechin）、表儿茶素没食子酸酯（Epicatechin gallate）、表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin gallate）、没食子儿茶素没食子酸酯（Gallocatechin gallate）、儿茶素没食子酸酯（Catechin gallate）、咖啡碱（Theobromine）、芦丁（Rutin）、天门冬氨酸（Aspartic acid）、精氨酸（Argininic acid）、谷氨酸（L-glutamic acid）、茶氨酸（L-Theanine）和茶黄素（Theaflavin）共13种化学成分；将各成分的化学结构式导入 SwissTargetPrediction数据库中，共计得到391个靶点，去重整合后最终得到165个靶点。

2.2 茶叶成分-靶点网络的构建与拓扑分析学结果

将[2.1]收集到的成分和靶点导入Cytoscape 3.7.2软件，构建茶叶成分-靶点络。图1显示，该网络由178个节点（13个成分，165个靶点）和391条边组成。图中绿色八边形表示纳入茶叶的主要成分，蓝色菱形为靶点。使用“Analysis network”对该网络进行拓扑学分析，进而获得Degree、BetweennessCentrality、ClosenessCentrality等多个参数值；其图形大小与颜色深浅与Degre值成正相关；Degree中位数为1，BetweennessCentrality中位数为0，ClosenessCentrality中 位 数 为0.268 404 91。Degree大于两倍中位数（≥2）的有80个节点，占44.9%。根据Degree值大小，排名前三位的成分有 Epicatechin gallate、Catechin gallate、Gallocatechin gallate 和 Epigallocatechin gallate；排名前三位的靶点有CA12、CA1、CA2、PTGS1，提示这些成分和靶点可能与癌症密切相关。网络拓扑基本信息见表1。

图1 茶叶13种化学成分-靶点的网络构建Figure 1 Network construction of 13 chemical components-targets in tea

表1 茶叶成分-靶点网络中关键节点的网络拓扑信息Table 1 Network topology information of key nodes in tea composition-target network

2.3 茶叶成分-疾病的交集靶点结果

以“Cancer”为关键词，在DrugBank数据库中查询得到58个靶点；同时在 Genecards数据库中查询得到候选靶点25 460个，通过“Relevance score”取三次中位数（n≥7.06）筛选得到3327个相关疾病靶点。将两个数据库得到的结果归一整合，共得到3350个疾病靶点；Venn图显示，药物与疾病的交集靶点共79个，提示这些靶点可能是茶叶治疗癌症的潜在靶点（图2）。

图2 茶叶成分-疾病交集靶点的Venn图Figure 2 Venn diagram of tea composition-disease intersection target

2.4 PPI网络构建及核心靶点筛选

将79个关键靶点导入String生物分析平台，物种选择为“人类”，分析其互作关系。网络显示共有79个节点683条边（超过预期值208），平均每个节点的Dgree值为17.3；有5个游离节点，将游离节点隐藏后导入Cytoscape 3.7.2软件，并根据 Degree 中位数（n≥14）选取核心靶点，结果如图3所示。图中显示共有40个节点440条边，节点的大小和颜色的深浅与Degree值成正相关，边的粗细代表Combine score值的大小，边越粗值越大。Degree值排名前十位的核心靶点有IL6、VEGFA、TNF、CASP3、EGFR、PTGS2、ESR1、MMP9、JUN、CCL2和CREB1，提示这些靶点可能是茶叶治疗癌症的核心靶点。

图3 核心靶点的PPI 网络Figure 3 PPI network of core target

2.5 茶叶成分-疾病靶点的GO及KEGG富集分析

2.5.1 茶叶成分-疾病靶点的GO富集分析

将[2.4]项下的40个核心靶点导入Metascape数据库，物种选择为“人类”，共确定4540个GO条目（P< 0.01），其中BP有3739个条目，涉及积极调控细胞迁移（positive regulation of cell migration）、调节平滑肌细胞增殖（regulation of smooth muscle cell proliferation）、对氧气水平的反应（response to oxygen levels）和白细胞分化（leukocyte differentiation）等；CC共有393个条目，涉及膜筏（membrane raft）、细胞质核周区域（perinuclear region of cytoplasm）、转录因子复合体（transcription factor complex）和 粘 附 连 接（adherens junction） 等；MF有408个条目，涉及细胞因子受体结合（cytokine receptor binding）、内肽酶活性（endopeptidase activity）、蛋白磷酸酶结合（protein phosphatase binding）和一氧化氮合酶调节剂活性（nitric-oxide synthase regulator activity）等。如图4所示，校正P值前十位条目的标准分数（z-score)。

图4 茶叶成分-靶点的GO富集分析Figure 4 GO enrichment analysis of tea components-targets

2.5.2 茶叶成分-疾病靶点的KEGG信号通路富集分析

将[2.4]项下的40个核心靶点导入Metascape数据库，物种选择为“人类”，进行KEGG信号通路功能富集分析，最终共确定353个条目（P< 0.01），根据校正后P值的大小取前20位通路，见图5气泡图。结果显示，主要涉及癌症的途径（Pathways in cancer）、癌症中蛋白聚糖（Proteoglycans in cancer）、小细胞肺癌（Small cell lung cancer）、癌症中的转录失调（Transcriptional misregulation in cancer）和前列腺癌（Prostate cancer）等。以上结果表明，茶叶中13种化学成分与抗癌作用密切相关，基本信息见表2。

表2 茶叶成分-疾病靶点的前20位KEGG信号通路富集结果Table 2 Enrichment results of the top 20 KEGG signaling pathways of tea components-disease targets

图5 茶叶成分-疾病靶点的KEGG信号通路富集分析气泡图Figure 5 Bubble chart of enrichment analysis of KEGG signaling pathway of tea components-disease targets

2.6 茶叶成分-靶点-通路的网络构建

综合上述分析得到的成分-靶点-通路结果，将其导入Cytoscape 3.7.2软件，构建“成分-靶点-通路”的网络关系图。由图6所示，涉及茶叶参与癌症调控的成分有11个，由红色圆形所示；靶点31个，由黄色圆形所示；绿色圆形表示为通路，其图形面积大小和颜色深浅与Degree值成正相关。其中，Aspartic acid与L-glutamic acid无对应靶点和通路。排名前十位的靶点有VEGFA、MAPK14、MMP2、MMP9、EGFR、IL6、CDK2、STAT1、TNF、CASP3、JUN、MET、NOS3和CREB1，提示这些靶点可能是茶叶治疗癌症的重要靶点。

图6 茶叶成分-靶点-通路的网络构建Figure 6 Network construction of tea components-targets-pathways

3 讨论与结论

近年来，随着我国医疗技术蓬勃发展，癌症的治疗手段也迈进了全新时代。分子靶向治疗与生物免疫治疗等现代化治疗技术在临床得到日益广泛的应用[13]。然而，生活习惯、工作环境、遗传与衰老等可能是诱发机体组织癌变的主要因素[14-16]，因此抗癌重在预防。中医素有“药食同源”之说，认为食疗的综合调摄是防治癌症的重要方式[17]。而茶叶因其独特的功效与滋味，最终被确定为一种可长期饮服的饮料[18]。唐代《本草拾遗》[19]记载：“诸药为各病之药，茶为万病之药。”现代研究表明，茶叶具有显著的抗癌作用[6-8]。本文通过文献调研[4,10-12]，最终纳入茶叶中13种主要成分进行网络药理学研究，为进一步探究茶叶抗癌的科学内涵以及茶叶的二次开发提供新思路。

3.1 茶叶“成分-靶点”抗癌作用

网络药理学研究结果表明，13种茶叶化学成分涉及165个靶点；合并DrugBank和Genecards数据库共收集癌症相关靶点3350个，其成分与疾病的交集靶点有79个；PPI网络确认IL6、VEGFA和TNF等40个核心靶点。

依据表1成分-靶点的网络拓扑结果分析，Dgree值排名前三位的成分分别是Epicatechin gallate、Catechin gallate、Gallocatechin gallate 和Epigallocatechin gallate，同属茶多酚类化合物。

Epigallocatechin gallate是茶叶中含量最丰富的茶多酚类成分，约占儿茶素总量的50%～80%[20]。在癌症的调控氧化应激、阻滞肿瘤细胞周期、抑制肿瘤血管生成和诱导癌细胞凋亡等分子机制方面发挥着重要作用[21]。CASP3是Caspase家族中介导细胞凋亡的关键执行分子，冯强[22]认为绿茶提取物Epigallocatechin gallate可能是MCF-7细胞中Caspase3蛋白活性增强的主要因素，对乳腺癌细胞有一定的抑制作用；Chen[23]课题组研究发现，Epigallocatechin gallate处理可致肾细胞癌细胞中MMP-2（基质金属蛋白酶2）和MMP-9（基质金属蛋白酶9）的下调，表明具有一定的抗癌作用；另有学者发现[24]该成分可抑制肝癌细胞增殖及诱导细胞凋亡, 其机制可能与TNF-α（肿瘤坏死因子-α）等炎症信号分子表达的变化有关。

Epicatechin gallate属黄烷醇类化合物。Kürbitz C 研究发现[25]，Epicatechin gallate和Catechin gallate对人胰管腺癌细胞的抑制效果比Epigallocatechin gallate强，尤其是Epicatechin gallate可抑制TNF-α诱导的NF-κB活化，并因此分泌促炎和侵袭促进蛋白；从成分的安全性角度来看，Epicatechin gallate可诱导人口腔癌细胞的凋亡，但对正常的细胞无明显影响[26]，表明该化合物对癌症的治疗安全有效。

此外，还存在一些Degree相对值不高但对癌症细胞有抑制作用的成分。在Theobromine与L-Theanine两种成分对二甲基肼诱导的结肠癌抑制作用的研究中发现[27]，两种成分单独或组合使用均通过下调Akt / mTOR和JAK2 /STAT3途径以及增加Smad 2肿瘤抑制因子来抑制肿瘤发生，其中组合使用时治疗作用更显著。Theaflavin是一类具有苯骈卓酚酮环结构的天然化合物。Tan[28]研究表明，Theaflavin通过诱导细胞周期停滞，对人结肠癌SW480和SW620细胞的增殖具有抑制作用，但对正常细胞的毒性较低，提示安全指数较高。

3.2 茶叶抗癌的核心靶点与作用机制

根据[2.4]项下PPI提取的核心靶点，获得排名前十位的靶点有IL6、VEGFA、TNF、CASP3、EGFR、PTGS2、ESR1、MMP9、JUN、CCL2和CREB1，其中IL-6、TNF与CCL2属于炎症因子，它们都与免疫炎症及组织坏死相关；在[2.5.2]项下KEGG通路分析显示，茶叶涉及多种癌症的相关通路、PI3K-Akt信号通路和NF-κB等信号通路，这些通路与炎症浸润和氧化应激有关。

IL6（白细胞介素6）作用的靶细胞很多，包括巨噬细胞、肝细胞、静止的T细胞、活化的B细胞和浆细胞等。Weber R表示[29]IL-6是骨髓来源的抑制性细胞在肿瘤发展中产生、积累和激活以及刺激肿瘤细胞增殖与存活及侵袭性与转移的重要因素。因此，IL-6可作为癌症的阴性预后标志物；EGFR（表皮生长因子受体）是HER家族成员之一，参与细胞增殖、分裂和周期调控等过程。茶氨酸及其衍生物可减少EGFR、MET、Akt和子宫颈癌细胞中的NF-κB，在人类宫颈癌中可能具有治疗或辅助治疗应用的潜力[30]；VEGFA（血管内皮生长因子）可诱导肿瘤等组织的血管生长，维持肿瘤的生长。VEGFA可激活PI3K[31]，而PI3K参与内皮细胞微管的形成，也参与内皮细胞增殖、存活、迁移和血管通透性的形成[32]；TNF多由激活的巨噬细胞和免疫细胞（B细胞和T细胞）等产生[33]。前列腺癌组织中存在高表达的TNF-α。此外，TNF-α可刺激生物体产生损伤细胞DNA的分子产物, 从而加速前列腺癌的发展[34-35]；PTGS2（前列腺素内过氧化物合酶2）是一种已被广泛研究作为癌症预后标志物的酶。PTGS2位于TGFβ的EPHA2信号传导的下游，PTGS2缺失可逆转T细胞排斥反应，并使肿瘤对免疫治疗敏感[36]；ESR1（雌激素受体1）的配体结合域中的体细胞突变是乳腺癌发展的关键介质。胰岛素样生长因子-1（IGF1）是乳腺发育和肿瘤发生的重要调节剂，而PI3K-Akt轴是介导ESR1突变细胞中增强的IGF1反应的主要途径[37]；MMP9（基质金属蛋白酶9）属于基质金属肽酶家族成员，它是一类复杂的内肽酶。Tsai等[38]研究表明NF-κB信号通路下游肿瘤进展相关MMP9与肝癌病灶生长、血管生成和转移密切相关，NF-κB信号通路抑制可显著降低其表达；JUN是一种原癌基因蛋白。Jun和Fos蛋白组成的AP-1因子可以调节生物学行为的基因表达，从而调节肿瘤细胞的侵袭性生长、肿瘤血管生成以及肿瘤转移[39]；CCL2（趋化因子配体2）是一类在炎症和病理条件下引导粒细胞迁移运动的可溶性蛋白分子，可调节单核细胞的浸润和迁移，在肿瘤和基质细胞中均高表达，并与肿瘤发生密切相关[40]；CREB1（cAMP反应元件结合蛋白1）是真核细胞中重要的转录调节因子。活化的CREB参与多种信号传导过程, 调控细胞的增殖、分化、凋亡及能量代谢，同多种肿瘤的生长及血管形成有关，能够介导细胞增殖并诱导细胞抗凋亡模式形成[41]。因此，CREB是一个重要的潜在抗肿瘤药物作用靶点。

综上，茶叶抗癌潜在的活性成分可能通过L6、VEGFA、TNF、CASP3、EGFR、PTGS2、ESR1、MMP9、JUN、CCL2和CREB1介导癌症的相关通路、PI3K-Akt信号通路与NF-κB等信号通路，参与炎症反应与氧化应激等过程达到防治癌症的目的。本文通过网络药理学的方法探究茶叶潜在的抗癌成分、靶点及作用机制，结合图1和表2，发现茶多酚类可能是抗癌作用的主要成分，多成分多靶点的综合调控是茶叶发挥药效物质基础的优势所在。本文仅在理论水平上进行探讨，虽然部分能与以往的研究对应，但还存在一定的发掘空间，期望不久的将来随着科学技术的发展，在实验水平上能够揭示更多的科学内涵。