黑果腺肋花楸酒对肝损伤小鼠肠道菌群的影响

李栋，侯建革，李艳，2，牟德华*

（1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050018；2.河北省发酵工程技术研究中心，河北 石家庄 050018）

黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpa），蔷薇科、腺肋花楸属（Aronia melanocarpa Mich Elliott）植物，俗称不老莓，根据2018年9月国家卫生健康委员会2018年第10号公告，黑果腺肋花楸为新食品原料。黑果腺肋花楸表现出降血脂[1]、降血糖[2]、抗癌[3]、抗炎[4]等多种药理作用。用其果实酿制的黑果腺肋花楸酒含有较多的单宁、花色苷、黄酮等酚类物质[5]，它们是发挥药理学作用的重要物质基础，具有显著的抗氧化能力。

在人和动物肠道内存在着大量的微生物菌群，生物体肠道健康与这些微生物有着密切的关系[6-8]，它们按照一定比例组合在一起，相互依存、制约、共生，形成相对稳定的肠道微生态[9-12]。宿主肠道为微生物群体提供营养和生存场所[13]，同时这些微生物也对宿主的营养、代谢和免疫功能调节发挥重要作用[14]。在正常肠道微生物菌群中，拟杆菌门及厚壁菌门最多，约占90%[15]，当生物体出现异常时，肠道菌群也随之发生改变，且随着生物体的年龄、饮食习惯、生活环境，甚至是心情的改变，都有可能使肠道菌群的改变。相反，肠道菌群也通过其特有的功能属性，影响宿主的生长和代谢[16]。

D-半乳糖已被广泛应用于建立实验性衰老、肝损伤等疾病模型[17]，研究发现，肝脏器官的健康状态与肠道菌群密切相关，肠道菌群的丰富度受到肝脏的影响，肝脏可以通过胆汁酸和免疫球蛋白A控制和调节肠道菌群[18]。而肠道菌群通过分泌小分子物质调节肝脏的正常功能，其中双歧杆菌和乳酸杆菌是肠道的主要益生菌，能够有效预防感染、维持肝脏正常功能[19]。本实验旨在研究黑果腺肋花楸酒对D-半乳糖急性肝损小鼠肠道菌群的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

黑果腺肋花楸酒：秦皇岛金樽酒业有限公司。

1.2 实验动物及分组

昆明小鼠SPF级，四周龄，体重22 g～26 g，雄性，由河北医科大学提供，许可证号：SCXK（冀）2018-004；实验动物质量合格证号：2010056。

小鼠适应性饲喂5 d，36只小鼠按平均体重分为3组，分别为：空白对照组（KB），模型对照组（MX）和实验组（HQ），每组 12 只，分两笼饲喂，即 KB1、KB2、MX1、MX2、HQ1、HQ2。其中空白对照组（KB）不作处理，正常饲喂；模型对照组（MX）按500 mg/（kg·d）的剂量注射D-半乳糖，直到实验结束；实验组（HQ），第一周同模型对照组，注射相同剂量D-半乳糖。后3周按照2 mL/（kg·d）的剂量灌胃黑果腺肋花楸酒。饲喂5周后，刺激小鼠排便，无菌eppendorf管收集粪便，-80℃冰箱暂存。

1.3 仪器与设备

AR1140电子分析天平：美国奥豪斯仪器有限公司；SW-CJ-IFD超净工作台：苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；D-1-70型自动控制压力蒸汽灭菌锅：北京发恩科贸有限公司；7HZ-82A水浴恒温振荡器：常州荣华仪器制造有限公司；902型-80℃冰箱：美国赛默飞世尔科技公司；NOVASEQ高通量测序仪：美国Illumina公司。

1.4 高通量测序检测小鼠肠道菌群多样性

每组随机选取6只小鼠粪便样品，48 h内保持低温送至上海派森诺生物科技股份有限公司进行高通量测序。上游引物F：ACTCCTACGGGAGGCAGCA，下游引物R：TCGGACTACHVGGGTWTCTAAT，测序区域：16S rRNA的V3-V4区。

1.5 数据处理

对测序结果双端合并后，用DADA2[20]方法进行去引物、质量过滤、去噪、拼接和去嵌合体等。生成扩增子序列变异体（amplicon sequence variants，ASV）特征序列和ASV表格，并去除序列总数仅为1的ASV。基于Greengene-13数据库进行物种注释。通过Alpha多样性，非量度多维尺度，基于属水平物种方法对肠道菌群进行多样性及物种分类的差异性分析。剔除组间差异性较大的小鼠肠道菌群数据最终分析KB1_4、KB2_2、KB2_4、KB2_6、MX1_6、MX2_2、MX2_3、MX2_6、HQ1_1、HQ1_2、HQ1_5、HQ2_4。同时提交 NCBI数据库进行登录样品信息，获得登录号为：PRJNA692530。

2 结果与分析

2.1 高通量测序结果

经过双端合并后，得到55 392条特征序列，经抽平后得到54 017条代表性序列，其序列长度最小值为319 bp，最大432 bp，平均422 bp，基本与16S rRNA V3-V4区的长度相符合。

2.2 Alpha多样性结果

2.2.1 Alpha多样性指数

Alpha多样性指数见图1。

图1 Alpha多样性指数Fig.1 Alpha diversity index

由图1可知，KB组与MX组在Chao1[21]多样性指数、Faith′s PD[22]指数、Good′s coverage[23]多样性指数、Pielou′sevenness[24]指数有明显差异，MX 组 Faith′sPD指数、Good′s coverage 多样性指数、Pielou′s evenness指数明显高于KB组，说明MX组中小鼠注射D-半乳糖后，导致肠道菌群多样性改变，造模成功。Faith′s PD指数相差较大，说明群落中物种的亲缘关系很远，通过Faith′s PD指数可看出MX组菌群与KB组菌群的亲缘关系相差较大。HQ组在各个指数上都接近于KB组，说明在一定程度上，黑果腺肋花楸酒对肝损伤后小鼠的肠道菌群有改善与修复作用。

2.2.2 稀释曲线

稀疏曲线是生态学领域的一种常用方法，通过从每个样本中随机抽取一定数量的序列（即在不超过现有样本测序量的某个深度下进行重抽样），可以预测样本在一系列给定的测序深度下，所可能包含的物种总数及其中每个物种的相对丰度[25-26]。稀释曲线的平缓程度反映了测序深度对于观测样本多样性影响的大小，曲线越平缓，表明测序结果已足够反映当前样本所包含的多样性，继续增加测序深度已无法检测到大量的尚未发现的新ASV；反之，则表明Alpha多样性尚未接近饱和。小鼠便样稀释曲线见图2。

图2 各组样本平均Shannon指数曲线Fig.2 The average Shannon index curve of each group of samples

由图2可知，在序列数达到50 000后，曲线已接近平缓，说明测序量已接近饱和，反映了样品中微生物的物种信息。同时还可看出，当曲线达到平缓时，MX组与KB组在物种多样性上有明显的差距，说明肝损伤的小鼠肠道菌群多样性相对减少，而HQ组与KB组接近，说明黑果腺肋花楸酒对肝损伤的小鼠肠道菌群多样性有效改善。

2.2.3 丰度等级曲线

丰度等级曲线可以直观地反映群落中高丰度和稀有ASV的数量。

每条折线代表一个样本，折线在横轴上的长度反映了该样本具有该丰度ASV的数目。折线的平缓程度，反映了群落组成的均匀度，折线越平缓，则群落中各ASV间的丰度差异越小，群落组成的均匀度越高，折线越陡峭，则均匀度越低。小鼠便样的丰度曲线见图3。

图3 丰度等级曲线Fig.3 Rank-abundance curve

由图3可知，MX组与KB组的ASV有很大差异，HQ组与MX组差别也很大，与KB组相似，说明黑果腺肋花楸酒对于肝损伤小鼠肠道菌群的丰度有明显改变，使其更接近于正常组小鼠样品的丰度，证明黑果腺肋花楸酒对肝损伤小鼠肠道菌群有明显的修复作用。

2.3 非量度多维尺度分析

非量度多维尺度分析（non-metric multidimensional scaling，NMDS）是通过对样本距离矩阵作降维分解，简化数据结构，从而在特定距离尺度下描述样本的分布特征。NMDS分析不依赖于特征根和特征向量的计算，而是通过对样本距离进行等级排序，使样本在低维空间中的排序尽可能符合彼此之间的相似距离的远近关系（而非确切的距离数值）。因此，NMDS分析不受样本距离的数值影响，仅考虑彼此之间的大小关系，对于结构复杂的数据，排序结果可能更稳定。NMDS结果的应力值越小越好，一般认为当该值小于0.2时，NMDS分析的结果较可靠，图中每个点代表一个样本，不同标识的点指示不同的样本或组。由于NMDS采用等级排序，因此可近似认为两点之间的距离越近，表明两个样本中微生物群落的差异越小。非量度多维尺度分析图见图4。

图4 非量度多维尺度分析图Fig.4 Non-metric multidimensional scale analysis graph

由图4可以看出，HQ组样本与KB组样本在图中位置直线距离比MX组与KB组的直线距离更近，说明MX组与KB组肠道微生物群落的差距较大，而HQ组与KB组的差距相对较小。说明黑果腺肋花楸酒使得肝损伤小鼠肠道菌群群落更加接近正常小鼠。

2.4 基于属水平的菌群分析

基于属水平3组小鼠肠道菌群物种组成分析见图5。基于属水平3组小鼠肠道菌群进化树图见图6。

图5 基于属水平3组小鼠肠道菌群物种组成分析Fig.5 Analysis of species composition of intestinal flora in 3 groups of mice based on genus level

图6 基于属水平3组小鼠肠道菌群进化树图Fig.6 Evolutionary tree diagram of 3 groups of mouse intestinal flora based on genus level

由图5可看出3组样品主势菌群的数量及比例，图6说明主势菌群的亲缘关系。MX组与KB组小鼠的肠道菌群中主势菌群的差异性明显。KB组小鼠便样的主势菌群占肠道菌群总量的35.2%，MX组仅为24.33%，而HQ组是36.36%。MX组在属水平肠道菌群排名前十的主势菌群比KB组减少很多，而HQ组比KB组还略高。拟杆菌属（Bacteroides）在3组样品中均占有主导优势，它是G-、无芽胞、专性厌氧的小杆菌，为正常寄居于人和动物的肠道、口腔、上呼吸道和生殖道的菌，可以分解蛋白胨或葡萄糖，产生琥珀酸、乙酸、甲酸、乳酸和丙酸等。MX组小鼠的肠道菌中拟杆菌属比KB组减少3.61%，而HQ组相比KB组增长10.5%。訾雨歌等[27]通过构建D-半乳糖诱导小鼠衰老模型，也发现模型对照组中拟杆菌属数量下降。乳杆菌属（Lactobacillus）是一种优质的益生菌，已有大量文献资料表明其具有促进肠上皮细胞增殖、参与调解结肠黏液层、重塑黏蛋白糖基化等功能[28]。李海燕等[29]通过构建急性肝衰竭小鼠模型，发现乳酸杆菌数量下降。阿克曼氏菌属（Akkermansia）是最近新发现的益生菌，具有改善糖尿病大鼠肝功能、减少糖毒性和脂毒性、缓解氧化应激反应、抑制炎症和恢复正常的肠道菌群等功能。阿克曼氏菌和瘤胃球菌科在长寿老人粪菌中相对丰度均较高，可能成为长寿信号之一[30-31]。以上从某种程度说明，肝损伤小鼠（MX组）的肠道菌群在属水平上与正常小鼠（KB组）差异显著，而黑果腺肋花楸酒对已经肝损伤小鼠的肠道菌群具有一定的修复作用，这种作用的体现是因为本实验所用黑果腺肋花楸酒中含有多酚和黄酮类物质，其含量分别为1.46 g/L和12.62 g/L，与Witkowska等[32]研究结果相似，但约12%vol的乙醇含量对肝也有损害作用，实验证明两权之间正作用大于副作用。

3 结论

MX组、HQ组与KB组比较发现，黑果腺肋花楸酒在一定程度上可以改善肝损伤小鼠肠道菌群，使得肝损伤后的小鼠肠道菌群丰富度基本与正常组相似。模型对照组小鼠肝损伤增加了肠道菌群的丰富度，但通过Faith′s PD指数可看出，增加的菌群种类与正常的种类在亲缘关系上有很大差异，说明，这些新增菌群可能与肝损伤有关。在非量度多维尺度分析也可以看出，HQ组比MX组跟KB组更相似。属水平看出，MX组相对KB组的主势菌群大幅度减少，而HQ组的主势菌群数量相对有所修复。本研究为黑果腺肋花楸酒的酿造、饮用及市场开发提供理论依据。