驴源马链球菌马亚种分离鉴定及消毒剂敏感性研究

平丽莹，江婉玲，马 勋，王 静

（石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832000）

马腺疫（strangles）是由马链球菌马亚种（Streptococcus equisubsp.equi，SEE）引起的一种以发热、精神沉郁、颌下及咽喉淋巴结脓肿等的临床症状[1]，且具有种属特异性的急性上呼吸道传染病，是最常见的马属动物的传染病之一[2-3]。马链球菌马亚种为链球菌属C群成员，革兰氏阳性，β溶血性链球菌，毒力基因包括透明质酸、肽聚糖、链球菌溶血素S等[4-6]，其中SeM蛋白是马链球菌马亚种重要的毒力因子，是细菌逃避吞噬作用和宿主免疫的重要保护性抗原，特异性高且高度保守，常被用来鉴定马链球菌马亚种[7-10]。

科学养殖、安全防控知识的缺乏导致驴感染马链球菌马亚种的病例时有发生[11]。现代规模化驴场对于疫病的防控除了对病原体检测和发病动物隔离治疗等措施外，场区内外的环境消毒及进出人员和动物的消毒是防控疫病发生最主要的措施之一[12]。消毒剂按杀菌效果分为高效消毒剂、中效消毒剂和低效消毒剂[13]。高效消毒剂包括卤素类消毒剂、氧化剂类消毒剂、醛类消毒剂；中效消毒剂包括含碘消毒剂、醇类消毒剂、酚类消毒剂；低效消毒剂包括季铵盐类消毒剂[14]。高效消毒剂可杀灭各类微生物，包含其芽孢；中效消毒剂可杀灭细菌繁殖体以及多数病毒和真菌；低效消毒剂可杀灭亲脂性病毒以及细菌繁殖体[15]。消毒剂的种类不同，杀菌机制也复杂多样。如何科学选择、使用消毒剂对于疫病防控极为重要。

2019年4月新疆石河子地区驴场发生一起疑似马腺疫疫情，为明确病原，了解驴源马链球菌马亚种的环境适应性及对消毒剂的敏感性。本研究对石河子地区发病驴场病原菌进行分离鉴定，并对分离株在不同培养条件下的生长特性及常用消毒剂的敏感性进行测定，以期对规模化驴场防控马腺疫提供参考。

1 材料与方法

1.1 病料来源

新疆石河子某驴场临床感染的驴及死亡驴颌下脓汁6份、肺部脓汁6份。

1.2 试验试剂

BHI培养基购自青岛高科技海博生物技术有限公司；胎牛血清、牛血清白蛋白、卵磷脂购自浙江天杭生物科技股份有限公司；PBS、新洁尔灭、来苏水、碘附、84消毒液、吐温80、硫代硫酸钠购自北京市庆盛达化工技术有限公司；琼脂粉购自上海索莱宝科技有限公司；革兰氏染液购自珠海贝索生物技术有限公司；革兰氏阳性菌GP鉴定卡购自北京兰伯瑞生物技术有限公司；无水乙醇购自北京庆盛达化工技术有限公司；细菌基因组提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。

1.3 试验仪器

SW-CJ-2FD洁净工作台购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂；HVA-85 Hirayama高压灭菌器购自山东博科生物产品有限公司；48230V LabeyderPCR仪购自广州市粤行仪器有限公司；ZHWY-2102C恒温培养振荡器购自上海智城分析仪器制造有限公司；IS-RDV1立式单门双层全温振荡器购自广州市深华生物技术有限公司；VITEK2-compact30全自动微生物鉴定仪购自北京兰伯瑞生物技术有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 病原菌分离纯化及生化鉴定

取临床感染的驴和死亡驴肺部及颌下脓汁直接接种于含5%脱纤维羊血BHI培养基，置于37℃恒温培养箱培养24 h，挑取产生典型β溶血的菌落进行纯化。

1.4.1.1 革兰氏染色

挑取鲜血培养基β溶血菌落，使用生理盐水制成细菌悬液，进行革兰氏染色。在油镜下镜检，观察其形态结构和染色特性。

1.4.1.2 生化鉴定

挑取纯培养物，采用GP鉴定卡及VITEK2-compac全自动微生物鉴定系统进行生化反应鉴定。

1.4.2seM测序鉴定

用细菌基因组提取试剂盒提取分离株DNA，引物参考《马腺疫检疫技术规范》（SN/T 2977—2011）扩增马链球菌马亚种seM基因。F5′-CAGAAAACTAAGTGCCGGTG-3′，R5′-ATTCGGTAAGAGCTTGACGC-3′，由北京华大基因科技有限公司合成。PCR扩增体系（总体积为20μL）：Premix Taq10μL、DNA模板2μL、上游引物1μL、下游引物1μL、超纯水6μL。PCR扩增程序：95℃预变性5 min；95℃变性40 s，61.7℃退火40 s，72℃延伸1 min，共35个循环；72℃延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行扩增片段大小的确定，并进行回收测序。

1.4.3 不同培养条件下的生长曲线的测定

取纯化后的细菌液体培养，菌液浓度达到1×108~5×108CFU/mL。取200μL的菌液和20 mL添加5%牛血清的THB液体培养基于锥形瓶中，在不同培养温度（25、37、42℃）、培养基pH值（4~9）、盐浓度（1%~5%）条件下测定0、2、4、6、8、10、12、14 h菌液OD600nm值，绘制生长曲线。

1.4.4 常用消毒剂中和剂的筛选

将0.5%碘伏的中和剂设为0.5%硫代硫酸钠+1%卵磷脂+1%吐温80和0.5%硫代硫酸钠+1%卵磷脂+3%吐温80；0.2%新洁尔灭中和剂设为1%卵磷脂+1%吐温80和1%卵磷脂+2%吐温80；1 000 mg/L的84消毒液中和剂设为5%硫代硫酸钠+1%卵磷脂+1%吐温80和1%硫代硫酸钠+2%卵磷脂+3%吐温80；5%来苏水中和剂设为3%吐温80[16]。参照《消毒技术规范》[17]，设置6个试验组，分别为：消毒剂+菌悬液、消毒剂+菌悬液、中和剂+菌悬液、消毒剂+中和剂+菌液、稀释液+菌悬液（阳性对照）、稀释液+中和剂+培养基（阴性对照）。试验结果需符合第1组无菌生长，或仅有极少数分离株菌落生长；第2组有菌落生长，且较第1组为多，但较第3，4，5组少；第3~5组有相似量试验菌生长，其组间菌落数误差率应不超过15%；第6组无菌生长[18]。

1.4.5 常用消毒剂对驴源马链球菌马亚种杀菌率的检测

取0.5 mL菌悬液、0.5 mL 3%牛血清白蛋白加入试管，混匀，置20℃水浴5 min后，加入不同浓度消毒液4.0 mL注入其中，迅速混匀并立即计时。至各预定时间后分别吸取0.5 mL混合液加于4.5 mL中和剂，混匀。作用10 min后，吸取1.0 mL混合液，按平板计数方法测定存活菌数，每管混合液接种2个培养基。阳性对照组用稀释液代替消毒剂溶液，所得结果代表菌液原有浓度。消毒剂试验设计见表1。消毒剂杀菌率的计算公式如下：

表1 消毒剂试验分组Tab.1 Disinfectant test group

2 结果与分析

2.1 病原菌分离纯化及生化特性（见图1、表2）

从发病驴和死亡驴的下颌脓汁和死亡驴肺部脓汁共分离到4株菌，XJ201901为死亡驴下颌脓汁分离，XJ201902为死亡驴肺部分离，XJ201903和XJ201904为发病驴下颌脓汁分离。

由图1可知，4株菌均为革兰氏阳性，长链状球菌，β溶血。

图1 分离菌镜检及血平板培养情况Fig.1 Microscopic examination of isolates and blood plate culture

由表2可知，4株分离菌生化鉴定结果均为马链球菌马亚种，置信度94%。

表2 分离株生化鉴定结果Tab.2 Isolate biochemical identification results

2.2 PCR鉴定结果（见图2）

图2 seM基因PCR鉴定Fig.2 PCR amplification of SeM gene for isolates

4株分离菌提取基因组DNA后，用seM基因特异性引物扩增seM基因片段。由图2可知，扩增产物经核酸电泳后可观察到1条长约542 bp的片段，经过测序对比分析，结果显示其序列与NCBI中登录的驴源马链球菌马亚种seM基因序列（MH973488.1）同源性均超过99%，说明4株分离菌株均为马链球菌马亚种。

2.3 分离菌株不同培养条件下的生长特性（见图3~图5）

由图3可知，4株分离菌在不同温度下生长情况明显不同，37℃条件下细菌生长迅速，4 h进入对数期并在8 h达到高峰，菌量可达108CFU/mL，8~14 h基本处于平台期。25℃条件下细菌生长缓慢，培养10 h后才有明显生长。42℃条件下，分离株比37℃早一步进入对数期，在6 h达到高峰，但总菌量低于37℃，平台期维持时间较短，8 h之后快速进入衰亡期。

图3 不同温度条件下4株分离菌生长曲线Fig.3 Growth curves of four isolates at different temperatures

由图4可知，4株分离菌在4%及5%盐浓度时不生长。1%和2%盐浓度4 h进入对数期，8~12 h处于平台期，12 h后细菌开始衰亡，生长趋势一致，但是2%盐浓度下细菌总量低于1%盐浓度3%盐浓度条件下细菌生长缓慢12~14 h才达到其最大值。

图4 不同盐浓度条件下4株分离菌生长曲线Fig.4 Growth curve of four isolates at different salt concentrations

由图5可知，4株分离菌在pH值为4、5、9时不生长；pH值为7、8时，细菌生长情况基本一致；但pH值为8条件下，细菌在衰亡期的下降要快于pH值为7的条件；pH值为6时，细菌生长缓慢，菌量始终显著低于pH值7、8。

图5 不同pH值条件下4株分离菌生长曲线Fig.5 Growth curves of four isolates at different pH values

2.4 常用消毒剂中和剂的筛选（见表3）

由表3可知，含1%卵磷脂和2%吐温80的PBS溶液可有效中和0.2%新洁尔灭，含1%卵磷脂、3%吐温80及0.5%硫代硫酸钠的PBS溶液可有效中和0.5%碘伏，3%吐温80的PBS溶液可有效中和5%来苏水，含3%卵磷脂、2%吐温80及1%硫代硫酸钠的PBS溶液可有效中和1 000 mg/L的84消毒液。

表3 中和剂筛选试验结果Tab.3 Results of neutralizer identification test

2.5 消毒剂对驴源马链球菌马亚种杀菌率的影响（见表4、表5）

分离鉴定表明，4株分离菌均为马链球菌马亚种且生长情况一致，试验选取菌株XJ201901对杀菌率的测定。由表4、表5可知，0.5%碘伏、1∶15新洁尔灭、1 000 mg/L 84消毒液以及5%来苏水溶液对驴源SEE的杀菌作用均达到100%。0.2%碘伏和500 mg/L消毒液的杀菌效果也可达到100%。0.05%碘伏、1%来苏水、200 mg/L 84消毒液对驴源SEE的杀灭作用达到90%以上。而在稀释更高倍数时1∶200新洁尔灭以及0.5%来苏水溶液的杀菌率下降到64%~76%，且消毒时间并不能增强消毒效果。

表4 消毒剂杀菌率Table 4 Germicidal efficacy of disinfectants 单位：%

表5 消毒剂杀菌率Table 5 Germicidal efficacy of disinfectants 单位：%

3 讨论

马链球菌马亚种对外界环境抵抗力较强，在水中可存活1 w，在干燥条件下可生存数周；对于热的抵抗能力不高，煮沸即死[19-20]；在阳光直射下的木材、橡胶和金属表面存活不到24 h；潮湿寒冷的环境可以提高SEE的生存能力[21]。本研究中，石河子发病驴场的驴在半露天围栏中饲养，围栏内躺卧位置没有垫草，发病前石河子气温较低，小雨，雨后露天围栏出现积水，有些驴躺卧在泥水中，种种因素导致驴机体抵抗力降低，陆续开始发病。本研究从临床发病及死亡驴颌下及肺部浓汁分离得到4株马链球菌马亚种，且此前驴场无其他发病史和感染情况，同时在发病驴体内未分离到其他致病菌，表明此次驴场发病由马链球菌马亚种导致。通过对4株驴源马链球菌马亚种在不同培养条件下生长特性的测定，发现分离菌在高温和偏碱环境中生长速度和细菌衰亡加快，室温、3%NaCl、pH值6的条件下细菌生长缓慢，表明驴源马链球菌马亚种对高温及酸性环境敏感。石河子地处北疆中段，冬季严寒，夏季炎热。因此，提示在石河子重点做好冬季和冬春的消毒保健能起到事半功倍的防控效果。

本试验研究的4种常用消毒剂，84消毒液属于卤素类消毒剂，高效消毒剂。来苏水属于酚类消毒剂，碘伏属于含碘消毒剂，均为中效消毒剂。新洁尔灭属于季铵盐类消毒剂，低效消毒剂[22]。84消毒剂在一般物体表面消毒时推荐使用浓度为1 000 mg/L。有效碘含量5 g/L的碘伏在注射、外科洗手及手术部位擦拭消毒时均使用其5%原液[23]。中效消毒剂来苏水推荐使用浓度在5%~1%之间；低效消毒剂新洁尔灭推荐皮肤及创面等消毒稀释比1∶15，器械冲洗消毒稀释比为1∶500[24]。试验结果表明，4种常用消毒剂在推荐使用浓度下均可以有效杀灭驴源马链球菌马亚种。84消毒剂和来苏水低于推荐使用浓度的5倍、碘伏低于使用浓度的10倍、新洁尔灭低于推荐使用浓度的7倍时，其杀菌效果将达不到预期效果。

4 结论

综上所述，石河子地区驴场此次发病由马链球菌马亚种导致，对于马腺疫的防控需严格按照消毒剂推荐使用剂量进行定期消毒，同时结合石河子气候条件，利用夏季高温晾晒，卤素类消毒剂对驴舍进行全面消毒，提高马腺疫的防控效果。