“红火球”紫薇组培快繁与抗褐化研究

李芳菲，杨利平，刘资华，时 群，陈丽文，何贵整，杨 琼

(1.钦州市林业科学研究所，广西 钦州 535099；2.广西国有钦廉林场，广西 钦州 535000)

紫薇(LagerstroemiaindicaLinn.)属千屈菜科紫薇属落叶灌木或小乔木，其树杆被微微触动，枝梢就颤动不已，故又名痒痒树[1]。紫薇树姿优美，花多绚丽，在夏季开花，花期长，抗逆性和滞尘能力强，对空气中的二氧化硫、氟化氢及氮气等具有较强的吸附能力，并具有药用价值，是集观赏、环境保护、药用于一体的木本花卉树种[2-3]。曾有诗句赞美紫薇：“谁道花无红百日，紫薇长放半年花”、“独占芳菲当夏景,不将颜色托春风”。“红火球”紫薇是从美国引进的优良新品，花期6—9月，头状花序，花色鲜红艳丽，远看犹如一团团火球，呈现花团锦簇之盛况；具有耐旱、耐低温、抗病性强、可多次开花等优良性状[4]，观赏价值高，有重要的研究和推广价值，应用前景广阔。

我国于2004年首次从美国引进“红火球”紫薇，随后，一些专家和学者开展了不同的研究。但对“红火球”紫薇繁殖研究局限于播种、扦插和嫁接等[5-6]。通过种子建立再生体系后代容易产生变异，因此不宜采用播种育苗的方式繁殖杂交品种[7]；扦插、嫁接等繁殖速度慢，不能满足市场需求。组培快繁技术能保持繁殖材料及新植株的优良种性，且繁殖速度快，繁殖系数高[8]，进行“红火球”紫薇组培快繁技术研究具有重要意义及应用前景。而“红火球”紫薇内含酚类物质较多，在组织培养中容易出现褐化现象，特别是初代培养时外植体褐化严重，能否克服褐化问题是组培成功与否的关键。本研究以“红火球”紫薇茎段为外植体进行组培快繁，旨在建立其无菌体系和探索抗褐化最佳配方，为“红火球”紫薇的规模化繁育和工厂化生产提供良好技术保障。

1 试验材料

以“红火球”紫薇当年生半木质化嫩枝茎段为试验材料，茎段采自广西钦州市林业科学研究所紫薇园的健壮母株。

2 试验方法

2.1 外植体预处理及消毒

在天气晴朗时，采集当年生健壮、半木质化的“红火球”紫薇嫩枝，去掉叶片(保留2～4 mm长的叶柄基部)，剪成约3 cm左右带腋芽的茎段，用自来水冲洗，在1%洗洁精溶液中浸泡5 min，用软毛刷轻轻刷洗茎段表面,再用自来水冲洗干净。将预处理好的外植体置于超净工作台上，按试验设计方案进行消毒。本试验选择75%酒精和0.1%升汞两种常规消毒剂，采用两种消毒方式(0.1%升汞、75%酒精+0.1%升汞)，其中75%酒精消毒时间为10 s，0.1%升汞消毒时间分别为6、8、10、12 min。然后用无菌水冲洗4～5次，剪掉外植体两端切口，接种到 1/2 MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L培养基上。每瓶接种1个茎段，每个处理接种10瓶，重复3次，每3 d观察一次，10 d后统计褐化率和污染率。

2.2 无菌芽诱导

采用上述试验筛选出的最佳消毒方法进一步进行试验。分别于4、6、9月3个不同时间段取材，剪取不同长度茎段(1、2、3、4 cm)接种到1/2 MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L培养基中，每瓶接种1个茎段，每个处理接种10瓶，重复3次，每3 d观察一次，15 d后统计褐化率、污染率、腋芽萌发率。

在1/2 MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L培养基上设计不同无机盐浓度(1/2 MS、MS)、不同添加物(L-半胱氨酸 1.5 g/L、VC 2.0 g/L、AC 0.2 g/L)，深入探索抗褐化最佳配方。每瓶接种1个茎段，每个处理接种10瓶，重复3次，每3 d观察一次，30 d后统计褐化率、腋芽萌发率、生长情况。

2.3 增殖和生根培养

从上述试验中筛选出最优培养基1/2 MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+VC 2.0 g/L+L-半胱氨酸1.5 g/L，分别添加不同浓度的生长调节剂6-BA(0.3、0.5、1.0、1.5 mg/L)、NAA(0.1、0.2 mg/L)。选取长势一致且健壮的无菌芽，切取长度为2～3 cm的茎段(带2～3个芽)接种到培养基上，每瓶接种3个茎段，每个处理接种10瓶，重复3次，每7 d观察一次，45 d后统计增殖、生根情况。

2.3.1培养基配置

以MS培养基为基础，设计不同浓度的大量元素、生长调节剂以及其他添加物。诱导、增殖培养基均添加0.38%琼脂粉、3%蔗糖，pH 5.6。分装后的培养基在121 ℃高压灭菌锅灭菌20 min，静置冷却备用。

2.3.2培养条件

培养室温度保持在(25±2)℃：空气湿度为70%～80%，光照强度为1 500～3 000 lx，光照时间为12 h/d。

3 结果与分析

3.1 不同消毒组合及消毒时间对外植体抗褐化及灭菌效果的影响

不同消毒组合、消毒时间对“红火球”紫薇外植体抗褐化及灭菌效果影响很大，而且8个消毒处理的褐化率均较高(表1)。

表1 不同消毒组合及消毒时间对外植体抗褐化及灭菌效果的影响

由表1可知，相同条件下，随着消毒时间的增加，外植体的褐化率逐渐升高，污染率则逐渐降低，而且主要是霉菌和细菌污染。用0.1%升汞消毒12 min时，褐化最严重，褐化率达90.4%。采用75%酒精消毒10 s，再用0.1%升汞消毒10 min时，褐化较轻，褐化率为73.3%，污染也较轻，污染率为10%。因此处理7是“红火球”紫薇外植体的最佳消毒方法。

3.2 不同取材时间及不同茎段长度对抗褐化及腋芽萌发的影响

取材时间对褐化率、污染率、萌发率都有极显著的影响。炎热夏季(6月)采集的外植体木质化程度高，内含酚类物质、内生菌、表面污染物均较多，因此，褐化率、污染率均相对较高，其次是秋季(9月)。春季(4月)气温相对较低，有利于抗褐化，而且半木质化嫩枝生长时间较短，内含酚类物质、内生菌、表面污染物均较少，因此褐化率、污染率相对较低，但萌发率相对较高。可见，春季(4月)采集腋芽茎段培养效果最理想(表2)。

选择适宜的外植体长度是组织培养是否成功的重要环节之一。从表2可以看出，在同一时间段采集的外植体，其褐化率随着茎段长度的增加而逐渐降低，萌发率则逐渐升高。但当茎段长度达到4 cm时，由于受高污染率的影响，萌发率降低。可见，外植体茎段不宜太短或太长，最适宜长度为2～3 cm。

表2 不同取材时间及不同茎段长度对抗褐化及腋芽萌发的影响

经过综合比较，春季(4月)采集“红火球”紫薇3 cm长腋芽茎段培养效果最好。

3.3 不同无机盐浓度及添加物组合对抗褐化及腋芽萌发的影响

不同无机盐浓度及添加物组合对抗褐化及腋芽萌发的影响结果见表3。

由表3可知，吸附剂、抗氧化剂均能不同程度地抑制外植体褐化。吸附剂、抗氧化剂的抗褐化效果依次为：VC>L-半胱氨酸>AC。但添加物组合使用比单独使用抗褐效果更好，当添加物组合为VC 2.0 g/L+L-半胱氨酸1.5 g/L时，抗褐效果最好，褐化率为50.2%。

表3 不同无机盐浓度及添加物组合对抗褐化及腋芽萌发的影响

1/2 MS与MS培养基均是添加吸附剂、抗氧化剂后抗褐化效果更好，特别在较低浓度的1/2 MS中，褐化率更低。实验结果表明，低浓度无机盐有利于抗褐化。当无机盐浓度为1/2 MS而添加物组合为VC 2.0 g/L+L-半胱氨酸1.5 g/L时，褐化率低至50.2%，萌发率高达66.6%，无菌芽长势好。因此，“红火球”紫薇诱导抗褐化最佳配方为1/2 MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+VC 2.0 g/L+L-半胱氨酸1.5 g/L。

3.4 不同生长调节剂及浓度组合对增殖及生根的影响

生长调节剂的种类、浓度及其组合是影响“红火球”紫薇继代增殖的关键因素。生长调节剂浓度太低对增殖作用不明显，浓度太高则抑制不定芽的生长。6-BA浓度为0.3 mg/L且与浓度为0.1 mg/L的NAA配比时，不定芽增殖系数较低，植株纤弱；6-BA浓度升高至1.5 mg/L且与浓度为0.1 mg/L的NAA配比时，不定芽的生长受到抑制，植株矮小，部分叶片变黑，部分幼苗褐化，出现死亡现象；当6-BA浓度为0.5 mg/L且与浓度为0.2 mg/L的NAA配比时，增殖系数高，植株健壮，长势佳(表4)。

表4 不同生长调节剂及浓度组合对增殖和生根的影响

不定芽在培养基1/2 MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+VC 2.0 g/L+L-半胱氨酸1.5 g/L中能“一步”成苗，而且长势好，芽增殖系数为4.2，苗高为4.3 cm，生根率为99.7%。综合考虑，确定1/2 MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+VC 2.0 g/L+L-半胱氨酸1.5 g/L为“红火球”紫薇最佳抗褐化的“一步法”壮苗生根培养基。

4 结论与讨论

1)“红火球”紫薇内含酚类物质较多，接种外植体易发生褐变，有效控制褐变是其组培快繁的关键技术。外植体变褐主要是由伤口处分泌的酚类化合物引起。被切割的外植体在灭菌、接种后，切面细胞中酚类物质被氧化成有毒醌类物质，致使切面迅速变成棕褐色或暗褐色，这些褐色物会逐渐扩散到培养基中，抑制细胞内其他酶的活性，毒害整个外植体组织[9]。

2)对外植体进行消毒处理是抗褐化、防污染的重要手段。该试验中,将外植体进行预处理后，用75%酒精灭菌10 s，再用0.1%升汞灭菌10 min为最佳消毒方法。

3)外植体采集的时间、茎段大小对抗褐化及腋芽萌发的影响很大。春季(4月)气温相对较低，有利于抗褐化，而且半木质嫩枝生长时间较短，内含酚类物质、内生菌、表面污染物均较少，所以，此时采集腋芽茎段培养效果最好。为降低褐化率，应剪取较长腋芽茎段。茎段太短小，相对伤口面积(伤口面积/茎段长度)就越大，组织内部代谢平衡受到干扰的程度越大，褐化率就越高[10]。但茎段过长时，内生菌及表面污染物多，难以彻底灭菌，容易污染。试验表明，“红火球”紫薇腋芽茎段长度约3 cm最适宜。

4)降低无机盐浓度、调整生长调节剂的种类及其浓度、在培养基中添加抗氧化剂和吸附剂等，均能有效防止褐化。试验结果表明,最佳抗褐化诱导培养基为1/2 MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+VC 2.0 g/L+L-半胱氨酸1.5 g/L；最佳抗褐化的“一步法”壮苗生根培养基为1/2 MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+VC 2.0 g/L+L-半胱氨酸1.5 g/L。

5)用“一步法”组培快繁“红火球”紫薇，芽增殖系数为4.2，苗高为4.3 cm，生根率为99.7%，能缩短成苗周期，节约成本，是“红火球”紫薇规模化繁育和工厂化生产的可行方法。