中药多糖含量测定方法研究❋

万晓莹， 刘振丽， 宋志前， 彭诗涛， 梁东蕊， 宁张弛， 王 淳

(中国中医科学院中医基础理论研究所， 北京 100700)

中药复方中每味中药的质量都与其临床疗效密切相关[1]。中药的质量控制包括有效成分或活性成分的定性鉴别、指纹图谱和含量测定。中药有效成分的含量高低是评价中药质量优劣的重要指标。多糖是很多常用中药如灵芝、云芝、玉竹、昆布、枸杞子、金樱子、铁皮石槲、海藻和黄精等[4]的主要有效成分，具有抗疲劳[2]、降血糖[3]和抗炎[4]等多种药理作用。因此，在《中华人民共和国药典》中，多糖是这些中药质量评价的指标。选取适当的多糖含量测定方法，对于科学评价以多糖为指标的中药质量，具有重要的实际应用价值。

由于多糖分子量大、结构复杂，缺乏发光基因，其含量测定方法的建立难度较大。《中华人民共和国药典》2020版均采用苯酚-硫酸法或蒽酮-硫酸法进行测定[5]。该方法以葡萄糖等单糖为对照品，简便可行，但其准确度常受待测多糖单糖组成的影响[6]。另有采用高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)法和气相色谱(gas chromatography, GC)法测定多糖酸水解后单糖的含量[7，8]，但酸水解条件对测量结果影响很大。上述方法均以单糖为指标计算多糖含量，不能对多糖的级分及结构进行有效分析，可能会影响多糖含量测定的准确性。随着科学技术的发展，高效凝胶渗透色谱(high performance gel permeation chromatography, HPGPC)法和近红外光谱(near-infrared reflectance, NIR)法等可测定多糖结构的分析手段，也已用于中药多糖的含量测定。本文归纳了目前中药多糖含量测定的相关文献，从多糖的直接含量测定和多糖水解后单糖的含量测定两方面进行总结，以期为相关研究提供参考。

1 多糖的直接含量测定

多糖的直接含量测定是指以单糖或多糖为对照品直接测出多糖的含量，目前常用的方法主要有紫外-可见分光光度(uv-visible spectrophotometer, UV-Vis)法、高效凝胶渗透色谱法(high performance gel permeation chromatography, HPGPC)、近红外光谱法(near-infrared reflectance, NIR)和碘量法。

1.1 UV-Vis法

该方法是利用多糖在浓酸的作用下水解成单糖，经脱水缩合形成糖醛衍生物，再与相应的显色剂结合显色，通过测定显色后的吸光度值大小来计算总糖含量的一种定量方法。常用的显色方法有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、3,5-二硝基水杨酸-硫酸法(3,5-Dinitrosalicylic acid，DNS)等。《中华人民共和国药典》2020版收载测定多糖的中药，除云芝多糖采用间接碘量法外，其他玉竹等8味中药和斛叶干浸膏的多糖含量均采用UV-Vis法测定。表1对该方法测定多糖含量的主要相关内容进行了归纳总结。

表1 UV-Vis法测定多糖含量主要内容归纳比较

采用该方法测定多糖含量需选择一种单糖作为对照品。药典采用的单糖对照品为葡萄糖和岩藻糖。大部分中药饮片的多糖含量测定均采用葡萄糖为对照品，如玉竹、金樱子、枸杞子等。对于海藻、昆布等来自海洋的中药，因其富含岩藻糖[9]则采用岩藻糖作为对照品。多糖的组成类型可分为均多糖和杂多糖。当多糖为均多糖时，采用一种单糖对照品就可以准确测定多糖含量。而当多糖为杂多糖时，按多糖的单糖组成及比例配制的混合单糖作为对照品，测定出的多糖含量才能更准确。如测定亮菌多糖含量时，应首先运用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolone,PMP)-柱前衍生HPLC法，测定其单糖组成及比例为葡萄糖(42.75%)、半乳糖(25.60%)、木糖(9.81%)、甘露糖(9.65%)、阿拉伯糖(6.64%)、岩藻糖(3.94%)。然后再依据测定结果配制混合单糖对照品，采用苯酚-硫酸法测定亮菌多糖的含量[10]。

目前《中华人民共和国药典》收载的多糖含量测定供试品溶液制备方法基本包括3种，一是中药经水回流提取后取滤液即可，该方法只适用于不含水溶性干扰成分的中药。目前药典中云芝、金樱子多糖均采用该方法测定；二是中药水回流提取后，水提液经醇沉处理得到沉淀，再加水溶解后进行测定。该方法可以去除水溶性成分对多糖测定的干扰，但乙醇浓度应保证中药中多糖沉淀完全。如戴平等[11]分别采用65%醇沉、75%醇沉、85%醇沉、95%醇沉工艺对莪术水提液进行处理获得莪术多糖，结果发现醇沉浓度为75%时莪术多糖的含量最高，随着醇沉浓度的增加，莪术多糖的含量反而降低，表明醇沉浓度过高或过低都不能使多糖沉淀完全，影响多糖的含量。目前药典中玉竹、灵芝、昆布、铁皮石斛、海藻多糖均采用该方法测定；三是中药首先采用乙醚、80%乙醇或丙酮除杂，经预处理后的残渣再加水回流提取并取滤液测定。对于含有色素、苷类等成分的中药，采用乙醚等脂溶性溶剂进行预处理可去除色素等脂溶性成分。采用80%乙醇或丙酮等极性溶剂可将苷类成分完全除去，以免硫酸水解时苷类成分中的糖基也被水解，与多糖水解产物一起与显色剂发生反应，使得测定结果偏高。目前药典中枸杞子、黄精、斛叶干浸膏多糖均采用该方法测定。

多糖含量测定的显色方法最常用的是苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法。苯酚-硫酸法可测定甲基化的糖、戊糖和多聚糖，而蒽酮-硫酸法测定的是溶液中全部碳水化合物的总量，所测值一般高于苯酚-硫酸法[12]。测定时具体的显色条件应通过实验筛选确定。如玉竹多糖与铁皮石斛多糖均采用苯酚-硫酸法进行测定，但玉竹多糖显色的水浴温度为40℃，而铁皮石斛多糖显色时则是放置于沸水浴中。灵芝、昆布多糖在加入蒽酮-硫酸溶液后室温放置，而黄精多糖显色则需置于水浴保温，因此具体显色条件应在考察后确定。田凤鸣等[13]采用苯酚-硫酸法测定京大戟多糖的含量，并从苯酚浓度(1%、3%、5%、7%、9%)、硫酸用量(3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL)、反应温度(20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃)、反应时间(10 min、20 min、30 min、40 min、50 min)4个方面对测定条件进行优化。结果表明，当苯酚浓度为5%、浓硫酸用量为5 mL，反应温度为100 ℃、反应时间为30 min时，苯酚-硫酸法的测定值误差最小。采用苯酚-硫酸法测定时需注意苯酚易被氧化成醌类物质，需在临用前进行重蒸馏，否则会造成吸光度的偏移或吸光值不稳，导致结果重复性差、准确性低。

DNS法主要用于测定还原糖含量，其原理是在碱性或中性的条件下，多糖水解后产生的还原糖能与DNS生成一种棕红色化合物，该化合物在一定范围内，其吸光度值的大小与还原糖的浓度成线性关系，可通过绘制标准曲线测定还原糖的浓度。此外，地衣酚-盐酸法也是一种测定多糖含量的方法，一般用于测定戊聚糖的含量。

UV-Vis法虽是目前最主要的多糖含量测定方法，但该方法是一种通用型的定量方法，一般只要化合物中含有羰基都能产生颜色反应，易出现假阳性[14]，准确性低，且不能体现组成多糖的单糖单元的特征，并不能满足现阶段对多糖质量评价的要求。

1.2 HPGPC法

采用HPGPC法测定多糖含量一般以多糖作为标准品。首先建立多糖分子量及分布分析方法，确定其特征色谱峰，再通过超滤等方法分离得到质量标志物(DOP)作为标准品，绘制标准曲线计算其含量。在待测多糖与现有多糖标准品分子量一致的情况下，也可直接采用魔宇葡甘聚糖、CM-阿拉伯聚糖、木葡聚糖作为标准品进行测定。由于多糖无发光基团，目前常用的检测器主要是蒸发光散射检测器(evaporative light-scattering detector, ELSD)、示差折光检测器(differential refractive index detector, RID)和多角度激光散射(multi-angle laser light scattering, MALLS)检测器。Xu J等[15]为评价不同品种和产地石斛质量，采用HPGPC-ELSD法确定了多糖分布，并通过超滤法分离得到铁皮石斛的DOP，进一步对不同地区的石斛多糖进行含量测定，显示石斛质量参差不齐。HPGPC-ELSD法不需破坏原有多糖成分的结构就可对中药中的多糖进行定性定量的优点，使HPGPC-ELSD法成为一种能快速准确测定多糖的新方法。

HPGPC-ELSD法虽能提高多糖含量测定的准确度，但需要分离得到DOP作为对照品，而DOP的选择和分离往往受限，使HPGPC-ELSD法的使用受到一定的限制。Cheong KL等[7]为解决这一问题，采用基于比折光指数增量值的HPGPC-MALLS-RID法测定多糖含量，以魔宇葡甘聚糖、CM-阿拉伯聚糖、木葡聚糖、松木多糖、燕麦β-葡聚糖、右旋糖酐(410、270和25 kDa)的混合多糖为对照品，并将测定结果与苯酚-硫酸法和HPGPC-ELSD法进行对比。结果显示，该方法在测定多糖及混合多糖含量时，多糖的组成和比例对结果的影响明显小于后2个方法，测定结果更准确。同时该方法成功被用于测定人参属中药人参、三七和西洋参多糖及其不同分子量级分的含量，结果显示其多糖及多糖分子量级分存在较大差异，该方法有助于改善人参属中药多糖的质量控制。

1.3 NIR法

NIR法不仅与被测样品的化学组分有关，还受样品大小、形状、密度等影响，此外基线的漂移及温度等条件变化也会影响光谱信号。因此，采用原始的光谱数据建立模型的精密度会降低，需用化学计量学方法对其进行预处理并将干扰信息和无用信息去除。常用的预处理方法有savitsky golay (SG)平滑、norris derivative (ND)平滑、一阶导数(first derivative, FD)、二阶导数(second derivative, SD)、多元散射校正(multiplicative scatter correction, MSC)、标准正态变量校正(standard normal variable, SNV)。Xie Y等[8]采用一种基于近红外光谱法和化学计量学的校准模型，检测不同产地香菇样品中的多糖含量。结果显示，该模型的预测均方根偏差(root mean square error of Prediction, RMSEP)和校正均方根(root mean square error of correction, RMSEP)分别为0.598和0.720，训练集和测试集R2分别达到0.958、0.925，说明多糖含量的预测结果与实际实验的结果之间无明显差异，显示该模型能够精确地预测香菇中香菇多糖的含量。

除以上几种测定多糖含量方法之外，滴定法也被用于多糖的含量测定，如药典中云芝多糖的测定采用的是间接碘量法，以硫代硫酸钠为滴定液，淀粉为指示剂，分别测定总糖与单糖含量，以总糖含量值减去单糖含量值即为多糖含量。但其操作过程较为繁琐，且滴定速度和摇晃的剧烈程度都会导致测定结果的误差，现在一般很少用于多糖含量的测定。

2 多糖水解后单糖的含量测定

该方法是通过将多糖水解后，检测多糖水解后单糖的含量，以单糖含量之和作为多糖含量。目前常用的方法主要有HPLC法、GC法和离子色谱法(Ion Chromatography, IC)。

2.1 HPLC法

采用HPLC法对多糖进行定量测定，是在分析多糖单糖组成的基础上，以相应单糖作为标准品，配制混合标准溶液，再将样品溶液和混合标准溶液衍生化，然后测定色谱峰面积并计算各单糖含量。该方法成功的关键在于多糖水解和衍生化条件。多糖水解的方法主要有酸水解法和酶解法，此外还有氧化降解法、超声降解法和辐射降解法等。常用的衍生化试剂包括PMP、2-氨基吡啶(2-Aminopyridine,2-AP)、对氨基苯甲酸酯、8-萘胺-1,3,6-三磺酸(2-Amino-3,6,8-naphthalenetrisulfonic acid ,ANTS)和苯甲酰氯等。其中最常用的是PMP试剂，因其能同时测定酸性、中性和碱性多糖[16]。刘宇等[17]采用PMP柱前衍生化高效液相色谱法结合外标一点法，测定了酸枣仁汤多糖水解后所得的甘露糖等4种单糖和半乳糖醛酸等2种糖醛酸的含量。

2.2 GC法

GC法测定多糖中单糖含量的原理与高效液相色谱法相似，也是在获得多糖单糖组成的基础上，经硅烷化或乙酸酯化处理，使单糖成为易挥发且对热稳定的衍生物，从而实现对多糖的定量测定。但其使用的范围比高效液相色谱法窄，仅适宜于测定热稳定且受热易挥发的单糖。孙莲等[18]采用水提醇沉法提取桑枝多糖，三氟乙酸水解多糖，水解产物用盐酸羟胺、吡啶和醋酸酐衍生化，生成糖腈乙酸酯衍生物，GC法测定桑枝多糖的单糖组成及含量。结果显示，新疆桑枝多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖等组成，含量分别为鼠李糖(11.8 mg/mL)、阿拉伯糖(14.4 mg/mL)、木糖(1.6 mg/mL)、甘露糖(1.9 mg/mL)、葡萄糖(22.3 mg/mL)及半乳糖(28.0 mg/mL)。GC法在测定时需注意载气的流速对各色谱峰分离度的影响，以确保结果的准确性。

2.3 IC法

IC法可根据多糖完全水解后产生的各单糖在碱性环境中可解离为带不同负电荷的阴离子，并利用其与阴离子交换柱保留时间的不同达到分离，从而实现多糖的含量测定[19]。该方法测定多糖中单糖含量时，无需进行衍生化前处理，即可分离测定，此方法灵敏度高、操作简单、分离度好。赵丹等[20]采用IC法分析了葛根多糖主要由岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖和核糖组成，并通过绘制峰面积-质量浓度标准曲线计算出这7种单糖的含量。

3 结语

多糖普遍存在于中药中，是中药有效成分之一。目前中药多糖含量测定主要分为多糖含量测定和多糖水解后单糖含量测定。《中华人民共和国药典2020版》第一部中多糖含量测定主要采用UV-Vis法，但存在需要完善之处。首先要注意对照品的选择。药典在测定多糖含量时，采用的对照品为单一单糖，当多糖组成为均多糖时可以采用单一单糖作对照品。但中药中的多糖大多为杂多糖，应按多糖的单糖组成及比例配制混合单糖作为对照品，测得的多糖含量更准确；二是供试品溶液制备方法，应尽可能地排除影响多糖含量测定的干扰因素。某些中药采用水回流提取后滤液直接作为供试品溶液，对于含有苷类等成分的中药，会影响测定结果的准确性。采用水提醇沉法制备供试品溶液时，乙醇的浓度应经过考察，以保证所有多糖都完全沉淀。如黄精多糖在药典中采用80%乙醇沉淀[5]。而课题组前期研究发现，HPGPC法分析显示90%乙醇才能将黄精多糖全部完全沉淀。

在多糖定性鉴别和糖谱分析中，实验条件同样也需要严格控制。目前，多糖水解后单糖的分析已用于含多糖中药的定性鉴别和糖谱分析。在进行单糖分析时，需注意严格考察多糖的水解条件。如课题组前期发现，采用文献方法水解黄精多糖会造成多糖的碳化而影响测定。多糖水解后单糖的测定主要采用HPLC法和GC法，其中GC法的应用范围较窄，仅适合于热稳定且受热易挥发的单糖，HPLC法应用范围宽，但样品前处理步骤繁琐。除了HPLC法和GC法，IC法测定样品不需衍生化的特点使其也逐渐应用于糖类的含量测定。HPGPC法和NIR法等具有高灵敏度的分析仪器也已用于中药多糖的含量测定，有效提高了多糖含量结果的准确性。随着精密仪器迅速发展，中药多糖含量测定方法逐步完善，但不同分析方法应用的条件不同，因此在进行多糖含量前应加以考察，以确保分析结果的准确性。