磁固相萃取联合荧光法测定生物样品中的卡维地洛

秦艳芳，赵冰欣，李晓姣，徐风云，吴 昊*

（1.长治幼儿师范高等专科学校，山西 长治046000；2.山西师范大学 化学与材料科学学院，山西 临汾041004）

卡维地洛（Carvedilol，CAR，图1）属于α和β受体阻断剂，可扩张血管，保护心肌和神经元，在临床上广泛用于高血压、心绞痛和心力衰竭等疾病的治疗，能显著降低心血管患者的发病率和死亡率［1－2］。

图1 卡维地洛的结构式Fig.1 The structure of carvedilol

磁固相萃取（MSPE）是21世纪发展起来的一项新型固相萃取技术，与传统的固相萃取相比，具有操作简便快速、成本低等优点［3－4］。共价有机骨架材料（COFs）是一类由轻质元素通过共价键连接的新型多孔有机材料，具有化学和热稳定性良好、比表面积大和孔径可控等优点［5］，在样品预处理领域具有广阔的应用前景［6］。

本研究采用Fe3O4纳米材料、1，3，5-三甲基间苯三酚（Tp）和联苯胺（BD），通过溶剂热法合成了Fe3O4＠COF（TpBD）复合材料。相比已有文献［7］，其合成方法所用试剂少，过程简单易操作，实验成本低。以Fe3O4＠COF（TpBD）为MSPE吸附剂联合荧光分光光度法建立了一种检测血浆和尿液中的CAR含量的新方法，通过优化相关实验参数，在最优实验条件下对该分析方法进行了评估。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

FeCl3·6H2O、乙二醇、无水乙酸钠、1，2-乙二胺、1，3，5-三甲基间苯三酚（Tp）、联苯胺（BD）（上海阿拉丁生化科技有限公司）；无水乙醇、冰醋酸、高效液相色谱级甲醇、乙醇、乙腈（北京百灵威科技有限公司）；CAR标准物质（中国药品生物制品检定所）；尿液及血浆取自长治幼儿师范高等专科学校校医院。

Cary Eclipse荧光分光光度计（Agilent Technologies，美国）；pHS－3C pH计（上海强生科技有限公司）；KQ－500DV超声波洗涤器（江苏昆山禾创超声仪器有限公司）；JEM－2100透射电子显微镜（TEM）（JEOL，日本）；D8 Advance X射线衍射仪（XRD）（Bruker，德国）；7407振动样品磁强计（Lake Shore，美国）；FT－IR360傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR）（Nicolet，美国）；ASAP 2020比表面和孔隙度分析仪（Micromeritics，美国）。

荧光测量条件：（25±0.5）℃；λex=240 nm，λem=356 nm；激发和发射狭缝宽度为5 nm；扫描速度为1 000 nm·min-1。

1.2 磁性材料Fe3O4＠COF（TpBD）的制备

Fe3O4纳米材料参照文献［4］制备：将1.0 g FeCl3·6H2O分散于20 mL乙二醇中超声处理，随后缓慢加入3.0 g无水乙酸钠，磁力搅拌30 min；加入10 mL 1，2-乙二胺搅拌30 min后，将混合溶液移至高压反应釜中加热至200℃并保持8 h，自然冷却至室温。最后将黑色产物用去离子水和乙醇洗涤数次，并在真空烘箱中60℃干燥24 h。

Fe3O4＠COF（TpBD）复合材料通过溶剂热法制备：取60 mg Fe3O4加至30 mL无水乙醇中超声分散，然后依次加入63 mg（0.3 mmol）Tp和55.2 mg（0.3 mmol）BD，混合物超声35 min后，移至高压反应釜中加热至180℃，保持48 h。最后将产物用去离子水和乙醇洗涤数次，并在真空烘箱中60℃干燥24 h。

1.3 样品处理

CAR标准溶液（0.1 mg/mL）：精确称取10 mg CAR，加1 mL的冰醋酸溶解，再加适量超纯水定容至100 mL。

血样处理：在具塞离心管中依次加入10 μL不同质量浓度的CAR标准溶液、2.0 mL血浆和8 mL乙腈脱蛋白，以4 000×g离心15 min。收集透明的上清液，待测。

尿样处理：在具塞离心管中依次加入10 μL不同质量浓度的CAR标准溶液和10 mL新鲜人尿，4 000×g离心10 min。收集透明的上清液，待测。

1.4 磁固相萃取过程

准确称取5 mg吸附剂Fe3O4＠COF（TpBD）置于50 mL含CAR样品溶液的比色管中，超声4 min，将钕铁硼磁铁置于比色管底部对吸附剂进行分离，弃去上清液后，将吸附剂在40℃氮气中吹干。然后准确量取0.5 mL乙醇置于比色管底部进行解吸，超声5 min后使用钕铁硼磁铁分离解吸剂和吸附剂，重复解吸步骤2次，合并两次解吸剂。最后将解吸剂用0.22 μm的针式过滤器过滤，滤液用于荧光分析。

2 结果与讨论

2.1 Fe3O4＠COF（TpBD）表征

利用TEM分别对Fe3O4和Fe3O4＠COF（TpBD）的形貌进行了表征。如图2A与图2B所示，Fe3O4呈球形，且大小均匀，表面被COF（TpBD）均匀包裹。元素分布图像（图2C）也表明Fe3O4＠COF（TpBD）中Fe3O4（元素Fe、O）和COF（TpBD）（元素C、N、O）均匀紧密地结合。

由Fe3O4和Fe3O4＠COF（TpBD）的N2吸附－解吸等温线（图2D）可知，Fe3O4的BET比表面积和孔体积分别为11.00 cm2/g和0.14 cm2/g，Fe3O4＠COF（TpBD）的分别为32.26 cm2/g和0.18 cm3/g，相比Fe3O4均明显增加。

Fe3O4和Fe3O4＠COF（TpBD）的磁化曲线（图2E）表明，两者均具有良好的磁性能，Fe3O4＠COF（TpBD）的饱和磁化强度为27.7 emu/g，在外磁场作用下容易分离。

从Fe3O4、COF（TpBD）和Fe3O4＠COF（TpBD）的XRD谱图（图2F）可以看到，Fe3O4有6个特征峰（2θ＝30.1、35.3、43.1、53.2、57.0、62.4）分别对应于（220）、（311）、（400）、（422）、（511）和（440）晶面，COF（TpBD）在2θ＝25.5处的特征峰对应其（001）晶面。Fe3O4＠COF（TpBD）图谱中这两种材料的峰都有体现，说明二者形成了复合材料，同时结晶度未发生变化。

如Fe3O4、COF（TpBD）和Fe3O4＠COF（TpBD）的FT－IR谱图（图2G）所示，Fe3O4＠COF（TpBD）在584 cm-1处的吸收带为Fe—O振动，3 432 cm-1和1 442 cm-1处的吸收带分别是O—H基团和芳香C====C单元的特征拉伸带，1 292 cm-1和1 605 cm-1处吸收带分别与C—N拉伸和C====N键有关。表明Fe3O4已成功被COF（TpBD）包裹。

图2 Fe3O4（A）和Fe3O4＠COF（TpBD）（B）的TEM图，Fe3O4＠COF（TpBD）的元素分布图（C），Fe3O4和Fe3O4＠COF（TpBD）的N2吸附－解吸等温线（D），Fe3O4和Fe3O4＠COF（TpBD）的磁化曲线（E），Fe3O4、COF（TpBD）和Fe3O4＠COF（TpBD）的XRD图谱（F）以及Fe3O4、COF（TpBD）和Fe3O4＠COF（TpBD）的FT－IR图谱（G）Fig.2 TEM images of Fe3O4 nanocrystal clusters（A）and Fe3O4＠COF（TpBD）（B），element mapping images of Fe3O4＠COF（TpBD）（C），N2 adsorption－desorption isotherms of Fe3O4 and Fe3O4＠COF（TpBD）（D），magnetic curves of Fe3O4 and Fe3O4＠COF（TpBD）（E），XRD spectra of Fe3O4，COF（TpBD）and Fe3O4＠COF（TpBD）（F），and FT－IR spectra of Fe3O4，COF（TpBD）and Fe3O4＠COF（TpBD）（G）

2.2 实验条件优化

2.2.1 pH值溶液的pH值会对药物与吸附剂间的吸附平衡产生影响。实验中溶液的pH值用B-R缓冲溶液调节。在溶液pH 2.0～12.0范围内进行MSPE和荧光检测。结果如图3A所示，随pH值的升高，CAR的荧光强度变化不大。为了方便操作，实验选择萃取溶液的pH值为6.0。

2.2.2 吸附剂用量考察了吸附剂用量在1～8 mg范围内对荧光强度的影响（图3B）。结果表明，当吸附剂用量为5 mg时，CAR的荧光强度最大。因此，实验选用5 mg吸附剂。

2.2.3 萃取时间考察了萃取时间为1～10 min时对CAR荧光强度的影响（图3C）。结果显示，荧光强度随着萃取时间的延长逐渐增加，当萃取时间为4 min时，CAR的荧光强度达到最大值，吸附过程达到平衡。因此，萃取时间确定为4 min。

2.2.4 解吸条件分别考察了乙酸、甲醇、乙醇和乙腈4种有机溶剂对CAR的解吸效果（图3D）。当选用乙醇为解吸剂时CAR的荧光强度最大。并考察了乙醇用量（0.2～0.8 mL）对CAR荧光强度的影响（图3E）。结果表明，改变乙醇用量，CAR的荧光强度变化不明显，为了方便操作，选用乙醇的体积为0.5 mL。另外，采用0.5 mL乙醇为解吸剂，考察了解吸时间在1～10 min范围内时对CAR荧光强度的影响（图3F）。结果表明，解吸时间为5 min时，CAR荧光强度最大。故选择最佳解吸时间为5 min。

图3 溶液pH值（A）、吸附剂的用量（B）、萃取时间（C）、解吸剂（D）、解吸剂的体积（E）和解吸时间（F）对CAR荧光强度的影响Fig.3 Effects of sample solution pH value（A），adsorbent amoun（tB），adsorption time（C），desorption solvent types（D），desorption solution volume（E）and desorption time（F）

2.3 方法选择性

在优化实验条件下，考察了某些共存物质以及常见离子对CAR（10 ng/mL）测定的影响。控制测量误差在±5%以内，1 000倍的尿素，800倍的Mg2+，700倍的K+、HPO42-，600倍的Na+、SO42-，400倍的Cl-，160倍的Ac-，120倍的Ca2+，56倍的Al3+，8倍的Cu2+等不会对测定造成干扰。可见该方法具有很好的选择性。

2.4 方法分析

在最优实验条件下，制备了一系列CAR溶液，以荧光强度（y）对质量浓度（x，ng/mL）绘制标准工作曲线，线性回归方程为y＝8.138x+4.555，R＝0.999 2。结果表明方法在1～100 ng/mL质量浓度范围内呈良好线性。CAR的检出限（S/N＝3）为0.19 ng/mL，定量下限（S/N＝10）为0.63 ng/mL，对溶液中CAR的富集倍数为113倍。可见该方法的灵敏度高，线性范围宽。

为考察方法的重现性，按照磁固相萃取步骤对1 ng/mL CAR标准溶液于日内和日间进行6次平行测定。计算结果表明，其日内相对标准偏差（RSD）为3.4%，日间RSD为3.6%。

2.5 样品分析

为了验证本方法的可行性及有效性，在尿样和血样中分别加入高、中、低3种不同质量浓度的CAR标准溶液，经“1.3”方法处理后，按照磁固相萃取过程进行加标回收实验。回收率测定结果如表1 所示，其范围为95.9%～98.7%。说明方法的准确性较好，可有效测定尿样和血样中CAR的含量。

表1 加标尿样和加标血样中CAR的荧光测定（n＝3）Table 1 Fluorimetric determination of CAR in spiked urine and spiked plasma（n＝3）

2.6 方法比较

相比其他文献方法（表2），本文所建立的方法线性范围宽，在加标样品中回收率高。

表2 生物样品中CAR检测方法比较Table 2 Comparison of determination for CAR in biological samples

3 结论

本研究合成了Fe3O4＠COF（TpBD）复合材料，并以Fe3O4＠COF（TpBD）作为MSPE吸附剂，联合荧光分光光度法建立了一种检测CAR含量的新方法。结果表明，该方法检测范围宽、灵敏度高且回收率好，适用于尿样和血样中CAR含量的测定。