不同消毒方法在洋葱组织培养中的应用及优化

董利萍 郭振锋 杜瑞卿

摘 要：分析不同消毒方法对洋葱种子处理影响的重要性，以便科学地筛选出主要因素及最优方案。对试验结果进行χ2检验、响应面法分析，结果表明，浸泡方法与时间对污染率、发芽率都有显著影响;三种不同杀菌剂处理对洋葱种子发芽率有显著影响; 70%酒精对污染率、发芽率无显著影响， 10%次氯酸钠有显著影响，两者与污染率Y1、发芽率Y2呈显著的二次回归函数关系;不同消毒液处理对污染率有显著影响。综合得出：在不含洗涤剂的温水中浸泡12 h，此时污染率低，发芽率高;不添加任何杀菌剂处理最好; 70%酒精处理（x1）2 min，与10%次氯酸钠处理（x2）10 min组合时，洋葱种子发芽率44.12%最高，污染率52.89%最低; 0.1%HgCl2和Tween20按比例10 000∶1的混合溶液消毒10 min结果最为理想。

关键词：洋葱;种子;消毒方法;统计分析;优化

中图分类号：S633.2 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2021）07-076-05

Application and optimization of different disinfection methods on onion tissue culture

DONG Liping1， GUO Zhenfeng1， DU Ruiqing2

（1. Department of Landscape Architecture， Henan Forestry Vocational College， Luoyang 471002， Henan， China;2. School of Life Science and Technology， Nanyang Normal University， Nanyang 473061， Henan， China）

Abstract： In order to study the importance of different disinfection methods on onion seed and find out the main factors and optimal solution， Chi square test and response surface method were used to analyze the experimental results. The results showed that the pollution rate and germination rate were significantly affected by soaking method and time. The seed contamination rate of onion was not affected by three fungicides， while the germination rate was significantly affected. Influencing factors A （70% alcohol） was found no significant effect on pollution rate and germination rate， while factors B （10% sodium hypochlorite）was revealed significant effect on pollution rate and germination rate. Different disinfectant treatments had significant effect on the pollution rate. It was concluded that the most reliable and ideal immersion method and time was soaking 12 h in warm water exclusive of detergent， and the pollution rate was low， the germination rate was high. The best fungicide treatment was control group， which was not added any fungicide. The optimum disinfection time combination was 70% alcohol（x1）for 2 min， 10% sodium hypochlorite（x2）for 10 min， and the germination and contamination rate of onion seeds were 44.12% and 52.89% 0.1% HgCl2 and Tween20 in the proportion of 10 000∶1 mixed solution disinfection for 10 min is the optimal combination.

Key words： Onion; Seeds; Disinfectant methods; Statistical analysis; Optimization

洋葱是百合科葱属中以肉质鳞片和鳞芽构成产品器官的二年生草本植物，营养丰富，而且具有杀菌、降脂、降压、抗哮喘等多种保健功能，深受人们喜爱。洋葱是两年生异花授粉作物，目前中国大多依然是常规育种，但耗时耗力，效率低，通常要12年以上，并且受种质资源的限制较大，很难取得进展[1-2]。近来年也有不少人用组织培养方法进行快繁，但是用种子进行组织培养，首先碰到的就是污染严重的问题[3-4]。关于洋葱种子采取不同消毒处理对污染率及发芽率的影响，有关文献[5]进行了报道，但存在以下不足：（1）浸泡方法与时间、三种不同杀菌剂处理、不同消毒时间处理、不同消毒液处理，每种处理方式的各组间，都是直观的数据比较，未进行统计学检验差异性，缺少科学性。（2）不同消毒时间处理，属于全面试验，但未能按照二次回归正交组合设计试验（响应面法）进行方差分析、建立回归方程，得出优选方案。（3）对各种不同的处理，2个不同的观察指标（污染率和发芽率目标要求相反）缺少有效的综合分析。基于此，笔者对不同消毒方法在洋葱组织培养中的應用，重新进行了实验设计，对实验结果进行了综合性的统计分析，以期为同类型研究提供新的实验设计方法和分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料是洋葱品种中生赤玉，来自北京市农林科学院蔬菜研究中心，于2019年4—5月在南阳师范学院生物楼实验室进行试验。

1.2 方法

1.2.1 洋葱种子浸泡方法与时间 对洋葱种子进行以下3种不同的浸泡处理：a）在含洗涤剂的温水中浸泡10 h;b）在不含洗涤剂的温水中浸泡10 h;c）在不含洗涤剂的温水中浸泡20 h。预处理后的种子先用70%酒精进行体表消毒1 min，用无菌水冲洗3次后，再用0.1%的HgCl2（HgCl2溶液中按10 000∶1的比例添加Tween 20）消毒10 min，最后再用无菌水冲洗3～4次后接种在培养基（MS基本培养基，pH 5.91，下同）中。对照是不做任何处理，直接接种。每个处理100粒种子。接种后先暗培养2 d，之后培养在室温25 ℃下，光照15 h·d-1，10 d后统计污染及发芽状况。

1.2.2 3种不同杀菌剂处理 在培养基中分别加入3种杀菌剂：多菌灵、甲基托布津、代森锰锌，每种培养基设2个质量浓度梯度，分别是1.2 g·L-1和2.4 g·L-1，摇匀，分装，常规高压灭菌。对照不加任何杀菌剂。每个处理100粒种子。先用70%酒精进行体表消毒1.5 min，用无菌水冲洗3次后，再用0.1%的HgCl2消毒10 min，最后再用无菌水冲洗3～4次。培养条件同上。10 d后统计污染及发芽状况。

1.2.3 不同消毒时间处理 用70%酒精分别处理1.5、2.0、2.5 min，用10%的次氯酸钠分别处理10、15、20 min，用无菌水冲洗过后接入培养基中，10 d后统计污染及发芽状况。

为了应用二次回归正交组合设计试验（响应面法）进行分析，对不同消毒时间处理进行水平编码，见表1。

对因素xj的各个水平进行线性变换，得到水平的编码z j =[xj-xj0Δ j]。其中，xj是j因素真实水平值，xj0是j因素0水平真实值，Δj是j因素1水平真实值减去0水平真实值的差值。

1.2.4 不同消毒液处理 将种子用70%酒精进行体表消毒1.5 min，用无菌水冲洗3次后，用3种不同的方法处理洋葱种子：a）10%次氯酸钠消毒10 min;b）0.1% HgCl2消 毒10 min;c）0.1% HgCl2和Tween 20按比例10 000∶1的混合溶液消毒10 min。之后再用无菌水冲洗3～4次，接种在培养基中。10 d后统计污染及发芽状况。

1.2.5 统计分析 对于洋葱种子浸泡方法与时间、3种不同杀菌剂处理、不同消毒液处理，采用“多个样本率的多重比较”[6]，所有组间采用k×2（k为组数）联列表χ2检验，对任2组间，采用四格表法检验。两组间的检验率为α'。

α'=[αC2k+1]                                                     （1）

k为比较的样本率个数，即相互比较的实验组数。α为所有组间的总体检验率，一般要求α=0.05。

不同消毒时间处理，采用二次回归正交组合设计试验（响应面法）分析。使用软件为SPSS 18.0和Design-Expert 8.0.

2 结果与分析

2.1 洋蔥种子浸泡方法与时间

试验结果见表2。3种不同浸泡方法与时间，与对照组比较，污染率显著降低，但发芽率表现不同，b组发芽率与对照组没有明显差异，a、c处理发芽率显著降低。

对表2 进行卡方检验，结果见表2最后两列。浸泡方法与时间对污染率、发芽率都有显著影响，污染率仅对照组与a、b、c有显著差异，而a、b、c间无显著差异;发芽率，仅对照与b无显著差异，其他组间相互都有显著差异。

综合统计检验表明，最理想的处理为b组，即在不含洗涤剂的温水中浸泡10 h，此时污染率低，发芽率高。

2.2 3种不同杀菌剂对洋葱种子的影响

表3表明，不同杀菌剂对污染率变化影响不大，但对发芽率变化影响大，比对照组显著降低了。

对表3进行卡方检验，结果见表3最后2列。3种不同杀菌剂处理对洋葱种子污染率没有显著影响，但对发芽率有显著影响，对照组与其他处理组间有显著差异，其他处理组间无显著差异。综合分析表明，最佳处理为对照组，即不添加任何杀菌剂。

2.3 不同消毒时间对洋葱种子的影响

试验方案及结果见表4，不同组合试验方案发芽率、污染率不同，变化较大，说明两因素对试验结果可能存在显著影响。

对表4中的污染率进行方差分析（表5），二次回归模型具有极显著性，影响因素A（70%酒精）、影响因素A、B交互项AB、影响因素A平方项A2影响不显著，影响因素B（10%次氯酸钠）、影响因素B平方项B2影响极显著。污染率y1与70%酒精处理时间（x1）、10%次氯酸钠处理时间（x2）的回归模型：

y1=-31.905 00+5.976 67 x1+14.771 67 x2+0.362 00 x1x2-5.760 00 x12-0.590 80 x22，预测值见表4，图形见图1。

由于影响因素B（10%次氯酸钠处理）对污染率影响显著，B因素3组间（处理时间10、15、20 min）多重比较表明：20 min 处理与10 min处理、15 min处理有显著差异，10 min处理与15 min处理无显著差异，10%次氯酸钠处理时间不应超过15 min。

对表4中发芽率进行方差分析的结果（表6）表明，二次回归模型具有显著性，影响因素A（70%酒精）、影响因素A、B交互项AB、影响因素A平方项A2、影响因素B平方项B2影响不显著，影响因素B（10%次氯酸钠）影响极显著。发芽率y2与70%酒精处理时间（x1）、10%次氯酸钠处理时间（x2）的回归模型：

y2=57.533 33-8.146 67 x1+2.322 33 x2-0.144 00 x1x2+0.040 000 x12-0.176 20 x22，预测值见表4，图形见图2。

由于影响因素B（10%次氯酸钠处理）对发芽率影响显著，B因素3组间（处理时间10、15、20 min）多重比较表明：3组相互间都有显著差异，随处理时间的增加发芽率显著下降，特别是20 min时，下降明显，10%次氯酸钠处理时间不应超过15 min。

污染率y1预测值越小越好，发芽率y2预测值越大越好，软件综合分析获得最佳试验条件为：70%酒精处理时间（x1）2 min，10%次氯酸钠处理时间（x2）10 min时，洋葱种子发芽率44.12%，污染率52.89%。

2.4 不同消毒液处理结果及分析

不同消毒液处理结果见表7。b、c处理与a处理比较，能显著降低污染率，同时也降低发芽率，但对发芽率的影响不是很明显。

对表7进行卡方检验，见表7最后两列，分析表明，不同消毒液处理对发芽率没有显著影响，对污染率有显著影响，a与b、c有显著差异，b与c间无显著差异。

综合统计检验表明，最理想的处理为c组，即0.1%HgCl2和Tween 20按比例10 000∶1的混合溶液消毒10 min。

3 讨论与结论

王仲等[7]研究表明，洗涤剂对翠菊种子的萌发有一定的抑制作用，随着处理浓度和处理时间的增加，抑制作用明显增强。本研究也表明不含洗涤剂的温水处理发芽率最高。

李翠翠等[8]研究表明，一定浸泡时间内，文定果种子的平均发芽率和平均发芽势随浸种时间的增加而增加，当浸种时间过长时，大量的水分阻隔了氧气，种子无法进行呼吸作用，使其缺少了萌发必要的物质和能量，导致萌发滞后，发芽率降低。本研究也表明在不含洗涤剂的温水中浸泡10 h发芽率最高，浸泡20 h发芽率反而降低。

丁成龙等[9]研究表明，多菌灵浓度过高有抑制种子发芽的可能;朱茜等[10]研究表明，代森锰锌剂量过高对蔬菜种子的萌发具有一定的抑制作用;甲基硫菌灵是一种广谱性内吸低毒杀菌剂，浸泡种子后被植物种子吸收转化为多菌灵，它主要通过干扰病菌菌丝形成和细胞分裂，使细胞壁中毒、孢子萌发畸形而杀死病菌，提高种子活力和发芽率，但其浓度过高，对发芽率有一定的抑制作用[11]。孙玉河等[12]的研究却表明，40%多菌灵处理的黄瓜种子发芽率为69.6%，高于空白对照的66%，但不显著。本研究也表明添加杀菌剂虽然可以降低污染率，但并不显著，反而显著降低了发芽率。本研究及文献都表明，虽然多菌灵、甲基硫菌灵、代森锰锌不同的浓度对不同的种子发芽率影响不同，但浓度高于一定标准（对不同蔬菜种子而言）都会抑制种子的发芽率，即使提高发芽率，也并不明显。

种子消毒不仅要把表面的微生物杀死，而且不能伤害其组织和表层细胞，以获得不污染且存活率较高的外植体。董飞等[13]研究表明，2%次氯酸钠处理的大葱种子发芽率显著高于0.1% HgCl2处理，但2%次氯酸钠处理的大葱种子污染率也显著高于0.1% HgCl2处理，与本研究基本相似。但本研究还表明在0.1%HgCl2中按照10 000∶1比例添加Tween 20后的混合溶液，既可以提高洋蔥种子的发芽率，同时又可以显著降低洋葱种子的污染率，是最为理想的消毒处理方案。

用70%酒精分别处理1.5、2.0、2.5 min，用10%的次氯酸钠分别处理 10、15、20 min，进行全面组合试验，二次回归正交组合设计试验（响应面法）分析表明，影响因素A（70%酒精处理）对洋葱种子污染率、发芽率影响不显著，影响因素B（10%次氯酸钠处理）对洋葱种子污染率、发芽率影响显著，污染率y1、发芽率y2分别与70%酒精处理时间（x1）、10%次氯酸钠处理时间（x2）存在显著的二次回归模型：

y1=-31.905 00+5.976 67 x1+14.771 67 x2+0.362 00 x1x2-5.760 00 x12-0.590 80 x22;

y2=57.533 33-8.146 67 x1+2.322 33 x2-0.144 00 x1x2+0.040 000 x12-0.176 20 x22。

污染率y1预测值越小越好，发芽率y2预测值越大越好，软件综合分析获得最佳试验条件为：70%酒精处理时间（x1）2 min，10%次氯酸钠处理时间（x2）10 min，洋葱种子发芽率44.12%，污染率52.89%。

由于蔬菜生长过程中发生的病害多由种子携带病菌引起，因此，播前对蔬菜种子进行消毒，可有效地减轻作物生长期间病害的发生[14-15]。杜燕等[16]比较了HgCl2、次氯酸钠及H2O2对油菜种子的消毒效果，结果发现10%次氯酸钠处理效果较好。崔学晨等[17]采用2%NaOH、KMnO4、紫外线、CuSO4等对生菜、油麦菜、大叶苦苣和韭菜等种子进行消毒处理，结果表明不同消毒方式对不同品种蔬菜种子发芽率和消毒效果的影响不同。因此本研究结果对于洋葱种子的消毒处理，具有重要的参考价值。

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