IL-22调控EAM小鼠心肌纤维化的初步研究①

陈 嘉 陈 蓉 曹毓文 夏 琳 刘 芳 苏兆亮

（江苏大学国际基因组学研究中心，镇江212013）

心脏纤维化是心脏疾病晚期常见的病理改变［1-2］。心脏纤维化的主要标志是成纤维细胞向纤维母细胞转化，基质分泌和降解不平衡［3］。在纤维化瘢痕的晚期阶段，胶原蛋白大量分泌，胶原蛋白通过基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）进行蛋白水解，形成稳定的纤维［4-5］。MMPs受金属蛋白酶组织抑制剂（tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs）负调控［6-7］。研究表明心脏在遭受刺激时，肾素-血管紧张素-醛固酮系统（reninangiotensin-aldosterone system，RAAS）被激活，释放的血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，ANGⅡ）直接或间接刺激TGF-β的产生，充当了心脏成纤维细胞的刺激剂［8-11］。由于心脏纤维化疾病的治愈率低，致死率高，所以积极寻找治疗心脏纤维化的可能靶点一直是人们关注的热点。实验性自身免疫性心肌炎（experimental autoimmune myocarditis，EAM）小鼠的心肌炎是由心肌球蛋白肽诱导产生的心脏损伤，当EAM发展到后期，小鼠心脏就会发展至纤维化［12-13］。

IL-22是IL-10家族成员，具有抗炎和促炎两方面的作用［14-15］。IL-22主要由免疫细胞分泌，如：Th17、Th22以及固有淋巴细胞等［16-17］。近年来，IL-22被认为在心脏当中具有保护作用［18］。然而，IL-22在心脏纤维化中的作用尚不完全清楚。本研究旨在通过研究IL-22对心脏纤维化以及TGF-β/Smad3信号通路的影响，探讨IL-22抑制心脏纤维化的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 α-SMA、β-actin、辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（Abcam，美国）；CollagenⅠ、Smad3、P-samd3（CST，美国）；ELISA kit（联科生物，中国）。

1.2 方法

1.2.1 Western blot检测α-SMA、CollagenⅠ及PSmad3的表达 小鼠心肌成纤维细胞株计数后按照细胞数量2.5×105个/孔均匀地种入24孔板中，检测α-SMA及CollagenⅠ表达时，设置对照组，ANGⅡ组（ANGⅡ处理12 h），IL-22+ANGⅡ组（IL-22预处理12 h后ANGⅡ处理12 h）。检测IL-22对信号通路的影响时，IL-22预处理成纤维细胞12 h后，ANGⅡ处理5 min。RIPA裂解提取各组总蛋白，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒流300 mA转膜，封闭后，加入按照说明书预先稀释好的一抗（α-SMA、CollagenⅠ、β-actin、Smad3及P-Smad3），4℃孵育过夜。TBST清洗后孵育对应的二抗，室温1 h；TBST清洗后显影。

1.2.2 细胞免疫荧光染色 细胞种于预先放置好爬片的细胞培养板内，加入相应的刺激剂。培养结束后，PBS清洗后依次经历0.1%Triton破膜，5%BSA封闭，预先稀释的一抗4℃冰箱过夜孵育，对应的荧光二抗避光、室温孵育，DAPI染色，清洗后使用荧光显微镜观察并采集图像。

1.2.3 ELISA法检测TGF-β、ANGⅡ表达 按照ELISA kit说明书完成对细胞培养上清中的TGF-β、小鼠血清中ANGⅡ含量的检测。

1.2.4 天狼星红染色 4%多聚甲醛固定心脏组织，常规石蜡包埋切，4μm厚片。切片二甲苯和梯度酒精脱去石蜡后，Weigert铁苏木素染色20 min，用流水冲洗10 min，天狼星红染色液室温滴染1 h。用流水稍冲洗切片，去除表面的染色液。最后脱水透明，再用中性树胶封片，光学显微镜观察并采集图像。

1.2.5 qRT-PCR 按照酚-氯仿法提取RNA，按照逆转录试剂盒的转录方法获得cDNA，以cDNA作为模板进行qRT-PCR，检测CollagenⅠ/Ⅲ的表达。

1.2.6 重组IL-22蛋白表达、纯化 将公司构建的IL-22表达载体进行转化和诱导表达后，将重组IL-22菌体收集、离心后，进行超声波破碎菌体并留取部分总菌液，剩下的菌液离心后分别收集上清与沉淀。将总菌液、上清与沉淀利用凝胶电泳检测重组IL-22的表达形式。由于重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，所以在诱导重组蛋白表达的过程中易于形成不溶解的包涵体，将包涵体进行变性及复性后获取可溶性的重组IL-22溶液。可溶性IL-22溶液经过镍柱亲和层析纯化后，获得纯度较高的IL-22蛋白，去除内毒素，BCA测定所获得蛋白的浓度。

1.2.7 动物实验 抗原肽制备：1 mg猪心肌球蛋白MyHC-α614-629（Ac-SLKLMATLFSTYASADOH）溶于1 ml PBS溶液中，与弗氏完全佐剂按照1∶1的比例混合，将试剂置于冰上研磨至油包水状态。BALB/c 6周龄小鼠分为对照组、EAM模型组、IL-22+EAM治疗组。对照组皮下注射PBS；EAM模型组和IL-22+EAM治疗组在第0天、第7天皮下注射抗原肽构建模型，IL-22+EAM治疗组在第14天开始尾静脉注射IL-22（300 ng/g），每隔1 d注射1次，直至28 d，处死小鼠，进行后续实验。

1.3 统计学分析 采用SPSS19.0软件进行数据分析，实验数据采用±s表示，两两之间比较运用独立样本t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 重组IL-22蛋白的表达和纯化 凝胶电泳结果显示，重组IL-22蛋白在15～25 kD之间有明显条带，并且主要存在于沉淀中，即以包涵体形式表达（图1A）。将包涵体进行变性和复性后的凝胶结果显示，部分重组蛋白在复性后转变为可溶性蛋白（图1B）。重组IL-22可溶性蛋白溶液进行纯化后可得到的纯度较高的蛋白（图1C）。将得到的重组蛋白进行BCA蛋白浓度测定，测得重组IL-22蛋白浓度为131 mg/ml。

图1 重组IL-22的表达及纯化Fig.1 Expression and purification of recombinant IL-22

2.2 IL-22对ANGⅡ诱导的心肌成纤维细胞胶原及α-SMA表达的影响 Western blot和细胞免疫荧光实验显示，IL-22+ANGⅡ处理后，与ANGⅡ处理组相比，Collagen和α-SMA的表达量下降（图2A、B）。qRT-PCR显示，与ANGⅡ组相比，IL-22+ANGⅡ组CollagenⅠ/Ⅲ的mRNA表 达 量 下 降（P＜0.01，图2C）。

图2 IL-22对ANGⅡ诱导的心肌成纤维细胞胶原及α-SMA表达的影响Fig.2 Effect of IL-22 on expressions of collagen andα-SMA in myocardial fibroblasts induced by ANGⅡ

2.3 IL-22对ANGⅡ诱导的心肌成纤维细胞TGF-β表达水平及下游信号通路的影响 ELISA结果显示，IL-22+ANGⅡ组与ANGⅡ组相比，TGF-β表达量降低（P＜0.01，图3A）。Western blot检测信号分子Smad3的磷酸化水平，结果显示ANGⅡ激活Smad3信号通路，但IL-22处理后Smad3磷酸化水平被抑制（图3B、C）。

图3 IL-22对ANGⅡ诱导的心肌成纤维细胞TGF-β表达水平及下游信号通路的影响Fig.3 Effect of IL-22 on expression level of TGF-βand downstream signaling pathways induced by ANGⅡin myocardial fibroblasts

2.4 重组IL-22干预后抑制了EAM小鼠晚期的纤维化 在诱导EAM模型后第21天和28天处死小鼠，摘取心脏，HE染色观察炎症浸润情况。结果显示，EAM小鼠21 d时炎症浸润程度最高，而28 d时炎症浸润程度减少（图4A）。本实验室前期实验结果表明，EAM模型在28 d时开始出现心脏纤维化的现象。ELISA结果显示，IL-22注射治疗后ANGⅡ表达量与EAM28天组相比明显减少（P＜0.05，图4B）。qRT-PCR结果显示，IL-22注射后CollagenⅠ/Ⅲ表达与EAM 28 d相比表达量降低（P＜0.001，图4C）。天狼星红染色结果显示，IL-22注射组的红色区域（胶原沉积部分）较EAM 28 d组减少，表明心脏纤维化被有效缓解（图4D）。

图4 重组IL-22干预后抑制EAM小鼠晚期的纤维化Fig.4 Interfering with recombinant IL-22 inhibits fibrosis in EAM mice

3 讨论

在心脏受损、稳态水平被破坏时，心脏基质重塑并导致心脏功能下降，最终发展为心脏纤维化［19］。心脏纤维化的主要表现是胶原沉积、肌成纤维细胞向纤维母细胞的转换以及肌成纤维细胞的增殖，心脏的顺应性降低且收缩和舒张功能障碍，最终导致心力衰竭和死亡［20］。因此，找到能逆转心脏纤维化发展的因素或药物迫在眉睫。当RAAS系统被激活后，ANGⅡ可以通过直接作用或者TGF-β介导的作用引起纤维化［21］。本实验表明IL-22通过抑制由ANGⅡ引起的TGF-β上调，从而抑制了成纤维细胞的表型转化。

近年研究表明，在器官纤维化的常见关键介质中，IL-10细胞因子家族凸显出了重要作用，IL-22作为IL-10家族的一员，因为与组织重塑相关而受到关注［22］。在已有的研究中表明，IL-22在心脏纤维化中具有保护作用，但是通过何种方式具有保护作用尚未研究清楚。本实验结果显示，IL-22通过抑制TGF-β下游的Smad3信号通路，阻断了成纤维细胞的活化。

综上所述，IL-22可以抑制TGF-β/Smad3的信号阻止成纤维细胞向纤维母细胞转化，缓解了EAM小鼠心肌纤维化的进程。