合成微生物群落强化可控固态发酵体系的研究进展

杨 旭，宋丽丽，张志平，马歌丽，魏 涛

（1.郑州轻工业大学 食品与生物工程学院，河南 郑州 450001；2.郑州市代谢工程和系统生物学重点实验室，河南 郑州 450001）

0 引言

数千年来，微生物群落一直被用于生物技术过程。如今，生物学家将微生物群落用于各种领域，如药物、生物燃料和生物材料等的生产过程。提高对自然微生物生态系统的认识，开发新的工具来构建合成微生物群落并规划它们的行为，将极大地扩展微生物群落的相互协作功能。

传统固态发酵技术一般被用于生产各种代谢产物，如酶、抗生素、有机酸、生物表面活性剂和芳香化合物等。目前，将传统固态发酵技术应用于代谢物生产、生物质开发利用和生物修复等方面，受到了广泛关注[1]。传统固态发酵过程通常是自然发酵产生，含有多个微生物群落[2]。由于天然微生物群落组成的波动性，发酵过程易出现代谢过程不易控制和产物不稳定等问题[3]。固态发酵过程具有原料成分多样、参与微生物种类多、代谢反应复杂、工艺繁复以及产品组分复杂等特征，导致难以科学地阐释其代谢机理。如何实现传统固态发酵生态系统的微生物功能可控、生产过程可控和产品品质可控是固态发酵行业面临的重大课题。有研究发现，微生物之间的相互作用会导致代谢产物的改善，如毕赤酵母和淀粉液化芽孢杆菌虽不是有效的风味化合物产生菌，但它们缓解了风味化合物产生菌（如酿酒酵母、东方伊萨酵母和地衣芽孢杆菌）之间的竞争，并改变了微生物的生长和风味化合物的产生[4]。微生物之间的相互作用在一些产香物质的代谢过程中起着至关重要的作用[5]。另外，微生物之间的相互作用是维持微生物群落共生的关键因素[6]。

目前，利用人工合成的微生物菌群将发酵过程从自然发酵转变为人工发酵是保证可控发酵的关键，因为自然菌群中仅有有限的微生物才能驱动发酵过程[7]。它们不仅产生相应的代谢产物，而且保持微生物之间的相互作用，从而实现成功的发酵过程[8]。因此，揭示这些核心微生物的组成，对于构建发酵过程的合成微生物群落至关重要[9]。

人工构建的合成微生物群落并不能够完全替代传统发酵方面的研究，而是通过建立一个实验条件下可控的系统来研究更深入的机制，以提高微生物群落应用于工业发酵的潜力。人工构建的微生物群落为研究传统发酵产生的原因奠定了基础，它可以在多个层面上进行微生物组的研究，还可以进行对某些特定微生物的基因修饰，从而研究不同组分之间的相互作用。最后，微生物群落的研究不仅可以帮助我们理解发酵过程的机理，还可以将这些知识应用到工业中，解决现在微生物组应用方面所遇到的问题，而且将合成微生物群落作为生物制剂的新策略可以构建新一代的发酵系统。合成微生物群落实现了从传统的单一细胞行为研究扩展到多细胞微生物群落行为研究。合成微生物群落能够通过微生物之间的相互作用，实现任务分工、功能互补，在白酒酿造、燃料生产以及污染物降解等领域有着重要的应用[10]。

1 合成微生物群落的特点

合成微生物群落是基于某个特定的目的（如模拟天然产物生产）将两种或两种以上的微生物在确定的环境条件下共同培养构建而成的人工群落体系[11]。合成微生物群落的构建需要考虑物种间相互作用、细胞间交流、物种代谢方式和群落空间结构等影响因素，目的是揭示发酵过程基本原理并产生可转化为工业应用的工艺[12]。对于合成微生物群落，其主要优点是可以在受控和可重复条件下详细地研究不同微生物的组成和功能分工，从而有助于在基因型和表型之间建立因果关系，以实现构建人工合成体系来研究微生物的功能。此外，合成微生物群落还可以在微生物和基因水平上进行添加、删除或者替换操作，在不同层面监测改变带来的不同结果，对于了解个体微生物在系统环境中的作用至关重要，有助于深入理解系统微生物生态的基本原理[13]。

合成微生物群落除了解析复杂发酵系统结构、功能和模型等明显价值之外，还可以为生物技术应用开辟新的途径[13]。目前，关于合成微生物群落的研究仍处于起步阶段，这个领域将会由于大量微生物基因组的测序以及大量微生物菌株的获得而得到快速发展。

2 构建合成微生物群落面临的挑战

目前，关于微生物组的研究仍停留在高通量测序以及数据关联性分析的水平上，这就导致关于微生物群落的组装、动态过程和抗逆性产生的原因等方面的研究还不清晰[14]。所以，要深入解决微生物组的问题，就需要严格设计一个在实验室条件下可控的微生物模式群落，这须要详细了解细胞间相互作用（包括细胞间通讯、细胞间代谢物和电子交换）和多细胞生理学的分子机制[15]。从某种意义上说，系统生物学方法能够系统地表征微生物群落中的遗传和代谢途径，这为理解微生物群落相互作用的综合分子机制提供了有用见解，可为如何构建功能性遗传部分以及具有确定特征和多细胞行为的微生物群落提供线索[16]。因此，系统生物学不仅有助于理解合成微生物群落，而且有助于合成微生物群落的设计和优化。

3 合成微生物群落在固态发酵方面的应用

3.1 合成微生物群落在白酒酿造方面的应用

目前，提高发酵食品产品质量的主要途径是构建合成微生物群落，合成微生物群落被广泛应用于白酒酿造中[17]。其中，重构大曲合成微生物群落，从而管理发酵过程，是未来白酒质量控制与工业化发展的目标[18]。

根据优势微生物的风味产生和共生功能，Wang SL[3]提供了一种系统方法来鉴定中国清香型白酒发酵过程中的核心微生物菌群（组成为Lactobacillus，Candida，Saccharomyces，Geotrichum和Pichia），见图1。在此基础上成功构建了一个合成核心微生物群落，以模拟体外发酵微生物群落的演替和风味化合物的产生。构建的合成核心微生物群落不仅促进了对微生物群结构和功能的理解，而且有利于建立可控固态发酵体系。

图1 中国清香型白酒发酵过程核心微生物群落组成Fig.1 Venn diagram of the core microbiota in the fermentation process of Chinese fen-flavor liquor

Ma R F[19]将多种菌株（S.fibuligera，S.cerevisiae和P.acidilactici）以不同的方式组合，通过气相色谱-质谱仪（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）和多元统计分析方法研究了所选微生物群落对白酒发酵代谢产物的影响。研究发现：在S.fibuligera和P.acidilactici的共培养物中，多数芳香族化合物的含量明显降低，可能是由于S.fibuligera和P.acidilactici之间存在负面的相互作用；由于S.cerevisiae和乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）的相互作用，在白酒酿造代谢的产物中，一些化合物（如醇和芳香族化合物）的产量明显增高。

3.2 合成微生物群落在木质纤维原料生物转化方面的应用

合成微生物群落的设计和构建在木质纤维原料高效转化生物燃料方面取得了重大进展[20]。Park E Y[21]构建了一个A.cellulolyticus C-1和S.cerevisiae ATCC4126组成的合成微生物群落（图2），显著提高了纤维乙醇的生产效率（1 g原料可以产生0.18 g乙醇）。

图2 利用木质纤维原料生产生物乙醇的合成微生物群落组成Fig.2 Synthetic microbial community for bioethanol production from lignocellulosic biomass

Minty JJ[22]开发了一个由真菌Trichoderma reesei RUTC30和细菌E.coli NV3 pSA55/69组成的合成微生物群落，该微生物群落能够以木质纤维为原料合成异丁醇。Trichodermareesei RUTC30分泌纤维二糖水解酶I（CBHI），纤维二糖水解酶II（CBHII）和内切葡聚糖酶I（EGI）可以预处理玉米秸秆形成可溶性糖，并进一步水解成葡萄糖而被E.coli代谢产生异丁醇。该微生物群落可以在定量动态模型指导下进行有效调控，并能够适应其他高价值化学品的生产。

杨旭利用复合乳酸菌群落（干酪乳杆菌、发酵乳杆菌和粪链球菌）对干玉米秸秆进行微贮预处理，以提高干玉米秸秆的乙醇转化能力，实验结果表明，在复合乳酸菌群落的厌氧发酵作用下，干玉米秸秆变得松软，致密的纤维结构受到破坏，内部结构出现空隙和裂缝，有效提高了干玉米秸秆的生物乙醇转化效率[23]。

3.3 合成微生物群落在生物修复方面的应用

与单一种群相比，合成微生物群落能够执行多项任务，这对于污染物的生物降解至关重要，因为污染物的完全降解涉及到通常不存在于单一菌株中的多种酶，而且任何一个菌株均不能单独执行污染物生物降解的总体任务[24]。目前，自然微生物群落已经被应用于环境生物修复，但是，仍然存在生物降解效率太低而不能完全满足工业要求的问题，因为这些微生物群落的首要任务是生存，这可能会限制其生物降解污染物的能力[25]。合成微生物群落可以通过引入新的遗传装置和模块来提高复杂污染物的生物降解效率[26]。

Dejonghe W[27]开发了一个包括5种菌株（Variovorax sp.WDL1，D.acidovorans WDL34，Pseudomonas sp.WDL5，H.sulfonivorans WDL6和C.testosteroni WDL7）的微生物群落（图3），该微生物群落能够降解除草剂利谷隆。其中，Variovorax sp.WDL1可将利谷隆降解为3，4-二氯苯胺和N，O-二甲基羟胺，D.acidovorans WDL34和C.testosteroni WDL7负责中间体3，4-二氯苯胺的降解，以保护Variovorax sp.WDL1免受中间体的毒害，H.sulfonivorans WDL6是唯一降解N，O-二甲基羟胺的菌株。

图3 合成微生物群落在有机生物降解中的种间相互作用Fig.3 Interspecific interactions in synthetic microbial community with organic biodegradation

Chen Y[28]培养了两种细菌Pseudomonas sp.XM-01（不能在烷烃上生长，但能够以甘油为唯一碳源生产鼠李糖脂）和Acinetobacter sp.XM-02（一种碳氢化合物降解细菌）组成的合成微生物群落，将其用于修复石油造成的污染。其中，Acinetobacter sp.XM-02降解碳氢化合物产生中间体，中间体被Pseudomonas sp.XM-01用于生产生物表面活性剂鼠李糖脂，从而增强Acinetobacter sp.XM-02降解石油的能力。

4 结论和前景

在过去的近二十年中，学者们通过合成生物学方法构建了许多具有多种相互作用模式的微生物群落并将其应用于许多领域。这些合成微生物群落的优势是它们具有明确的遗传特征，并且组分之间具有易处理和可调节的相互作用，这使得学者们能够通过许多合成生物学工具来优化它们的行为。

然而，迄今为止，学者们构建的合成微生物群落一般相对简单，其中仅有两种或三种工程微生物。由于天然环境（如海洋，土壤，污泥和石油）的生态结构、相互作用模式、波动环境和进化压力的影响，使得复杂生态系统的合理设计和优化极具挑战性。合理设计和合成能够执行复杂生态或生物功能的种间生态系统将是一种趋势。这样的工程生态系统将作为新的模型系统来模拟天然存在的复杂时空行为，以利用自然界中观察到的细胞间通信和协同合作，为时空微环境和物种间代谢相互作用对多种微生物群落稳定共存的影响提供新的见解，从而解决许多复杂的生态学问题。这些合理设计的微生物生态系统还将在化学工业、能源、环境和医疗保健领域实现新的应用。