HPLC法测定金荞麦药材中表儿茶素、金丝桃苷、槲皮苷的含量

阮洪生，张兆远

（1.浙江医药高等专科学校中药学院，宁波315503；2.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆163316）

金荞麦为蓼科植物金荞麦Fagopyrum dibotrys(D.Don)Hara的干燥根茎，浙江习称金锁银开，味微辛、涩，凉，归肺经，具有清热解毒、排脓祛瘀的功效，临床用于肺痈吐脓，肺热喘咳，乳蛾肿痛等证的治疗[1]。金荞麦的主要活性成分为原矢车菊素、槲皮素、表儿茶素-3-没食子酸酯等黄酮类化合物[2]。《中国药典》中金荞麦药材的含量测定标准采用单一的表儿茶素作为对照品[1]，研究表明，金荞麦中还含有金丝桃苷、槲皮苷等黄酮类成分[3-6]，为更好地控制金荞麦的质量，本实验建立了HPLC法测定金荞麦中表儿茶素、金丝桃苷、槲皮苷的含量测定方法，为其质量标准的研究和相关产品的进一步开发利用提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Shimadzu LC2010HT高效液相色谱仪、LCsolution色谱工作站(日本岛津)；电子天平FA2004N（上海精密科学仪器有限公司）；KQ-600E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；RE52-99旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 材料

金荞麦，黑龙江康麦斯药业有限公司提供，经鉴定为蓼科植物金荞麦Fagopyrum dibotrys(D.Don)Hara的干燥根茎[1]；色谱甲醇（天津市福晨化学试剂厂）；色谱乙腈（天津市光复精细化工研究所）；分析纯磷酸（沈阳市华东试剂厂）；表儿茶素标准品（批号：ZY151110）、槲皮苷标准品（批号：ZY151112）、金丝桃苷标准品（批号：ZY151109）（克拉玛尔公司）；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为waters C18柱(4.6mm×150mm，5μm)，填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶。表儿茶素测定的流动相为乙腈-0.004%磷酸水溶液（10∶90，v/v），测定波长为280nm[1]；金丝桃苷测定的流动相为甲醇-0.004%磷酸水溶液（50∶50，v/v），测定波长为345nm[4]；槲皮苷测定的流动相为甲醇-0.004%磷酸水溶液（45∶55，v/v），测定波长为345nm。流速均为1.0mL/min；柱温均为35℃；进样量均为10μL。洗脱方式均为等度洗脱。

2.2 对照品溶液制备

分别精密称取表儿茶素、金丝桃苷、槲皮苷标准品各2mg置于10mL容量瓶中，加入色谱甲醇溶解并稀释至刻度，超声30min，经微孔滤膜（0.45μm）过滤，滤液作为对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备

精密称取金荞麦粉末20g，加240mL蒸馏水回流提取2次，每次3h，减压抽滤，合并滤液，水浴蒸干，残渣加乙腈-水（10∶90)混合溶液分次洗涤，洗液转移至10mL量瓶中，加乙腈-水（10∶90)混合溶液至刻度，摇匀，离心5min（3000转/min），精密量取上清液5mL，加于聚酰胺柱（80~100目，内径为1.0cm，柱长为15cm，湿法装柱）上，以蒸馏水50mL洗脱，弃去水液，再用95%乙醇100mL洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，残渣用乙腈-水(10∶90)混合溶液溶解，转移至10mL量瓶中，加乙腈-水(10∶90)混合溶液稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液[1]。

2.4 方法学考察

2.4.1 系统适应性实验

取表儿茶素、金丝桃苷、槲皮苷对照品溶液、金荞麦供试品溶液在上述色谱条件下进行测定。由图1可知，表儿茶素、金丝桃苷、槲皮苷对照品的色谱峰与金荞麦供试品的色谱峰一一对应，且其峰形对称，分离效果好。

图1 色谱图谱

2.4.2 线性关系

分别精密吸取表儿茶素、金丝桃苷、槲皮苷对照品溶液2.00、4.00、6.00、8.00、10.00μL，按“2.1”项下方法进样，测定峰面积。以对照品溶液进样体积X为横坐标，峰面积积分值Y为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程。结果见表1和图2。试验表明表儿茶素、金丝桃苷、槲皮苷在0.40~2.00μg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

表1 标准曲线测定数据

2.4.3 精密度考察

取表儿茶素、金丝桃苷、槲皮苷对照品溶液，按“2.1”项下方法，分别连续6次进样，每次10μL，测定表儿茶素、金丝桃苷、槲皮苷峰面积积分值。结果RSD分别为1.09%、0.46%、0.92%(n=6)。表明精密度符合要求。

2.4.4 稳定性考察

取金荞麦供试品溶液，按“2.1”项下方法进样，测定6次，每次间隔2h，测定表儿茶素、金丝桃苷、槲皮苷峰面积积分值。结果RSD分别为1.16%、0.91%、0.48%(n=6)，表明样品在12h内稳定。

2.4.5 重现性考察

取金荞麦供试品溶液，按“2.1”项下方法进样，连续6次进样，每次10μL，测定表儿茶素、金丝桃苷、槲皮苷峰面积积分值。结果RSD分别为0.93%、0.67%、0.81%(n=6)，表明重现性符合要求。

2.4.6 加样回收率试验

采用加样回收法实验。取已知含量的供试品5份，每份0.5g，分别加入一定量的表儿茶素、金丝桃苷、槲皮苷对照品，按“2.1”项下方法进样，计算平均回收率和RSD值。表2结果表明，3种成分的平均回收率均接近于为100%，RSD均较小，表明本方法回收率较高，选择的含量测定条件可行。

表2 加样回收率实验结果

2.5 样品含量测定

精密称取3份金荞麦粉末，每份20g，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下方法进样，测定表儿茶素、金丝桃苷、槲皮苷的峰面积积分值，以外标法测定并计算含量。结果见表3。

表3 金荞麦中表儿茶素、金丝桃苷、槲皮苷含量测定结果（n=3）

3 讨论

3.1 流动相的选择

溶剂的极性是选择流动相的重要依据，反相色谱一般采用一定比例的甲醇或乙腈作为流动相。本研究中测定表儿茶素时选用乙腈作为有机相，测定金丝桃苷和槲皮苷时选用甲醇作为有机相。此外，待测的表儿茶素、金丝桃苷和槲皮苷均为酸性成分，为达到最佳的分离效果，流动相中添加极少量的磷酸。

3.2 流速对分离度的影响

根据速率理论，在一定范围内降低流速可以提高柱效，增大分离度，但流速过慢，分析时间延长，纵向扩散的影响变大也会降低柱效，经试验后最终确定流速为1.0mL/min。

3.3 柱温对分离效果的影响

柱温会影响组分在两相中的分配系数，实验发现，在一定范围内升高柱温，会缩短被测物质的保留时间，增大分离度，但柱温太高会降低柱效，并会降低分离条件的可适用度。结果显示当柱温35℃时，金荞麦各组分分离度已基本达到要求，因此，最终确定检测温度为35℃。

本研究建立了金荞麦中表儿茶素、金丝桃苷、槲皮苷的HPLC含量测定方法。该方法操作简便，重复性高，稳定性好和专属性强，并且分析时间短，迅速地提高了分析效率，可作为金荞麦黄酮类成分的含量测定方法。