基于网络生物信息学筛选精神分裂症关键基因

吴亚娟，赵 楠，钱科佳，惠 涛，潘继英

（张家港市第四人民医院精神科，江苏 张家港 215600）

目前精神分裂症（schizophrenia）病因尚不清楚，通过现象学方法无法辨别因果关系，而有关基因功能和遗传变异的研究对阐明精神分裂症的病因机制和了解环境因素对精神分裂症的影响都具有重大意义[1]。近十年来精神分裂症的全基因关联研究改变了精神病学的研究领域，表明了在分子水平上精神分裂症具有潜在的生物学基础[2]。用人类多能干细胞和含有风险相关变体的基因组细胞建立精神分裂症患者的神经元模型正在开展[3]。以基因为切入点，研究精神分裂症风险相关的基因或可构建观察和治疗目标的系统模块。然而，目前有文献报道的精神分裂症风险基因很多，彼此缺乏系统联系。基于此，本研究采用生物信息学方法对精神分裂症编码基因进行分析，以期寻找更为精准的候选基因。

1 资料与方法

1.1 资料来源 于大鼠基因组数据库（https://rgd.mcw.edu/wg/，RGD）中搜集人源精神分裂症编码基因。

1.2 方法

1.2.1 精神分裂症编码基因的获取 在RGD 数据库检索“schizophrenia”，在Results Matrix 中选择human 下的gene 及protein-coding，即获取人源精神分裂症的编码基因，检索获得391 条基因信息。

1.2.2 基因本体功能注释（GO）使用在线基因注释软件（https://david.ncifcrf.gov/）对精神分裂症相关编码的391 个基因进行GO 功能富集分析，以P＜0.05为筛选条件，从生物过程（biological process，BP）、细胞组成（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）三方面对391 个基因最可能涉及到的功能进行筛选，将结果以txt 文本格式保存，后利用R 软件作图。

1.2.3 京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集析 使用在线基因注释软件（https://david.ncifcrf.gov/）对391 个基因进行KEGG 通路富集分析，以P＜0.05 为筛选条件，筛选最可能涉及到的通路，将结果以txt 文本格式保存，后利用R 软件作图。

1.2.4 蛋白相互作用网络分析 使用在线软件（https://string-db.org/）对391 个基因构建蛋白质相互作用网络图，预测编码蛋白间的相互作用，将391 个基因以基因列表的形式上传网站，后点击左栏multiple proteins 按钮，将筛选条件设置为combined score 即相互作用分数大于0.7，导出结果以TSV 格式保存。

1.2.5 关键基因的筛选 将String 网站下载的结果TSV 文件导入到cytoscape 软件（3.6 版本），利用插件Mcode 筛选关键模块，以cytohubba 插件筛选热点基因，为提高筛选的可靠性，取用cytohubba 中的degree、mcc、mnc3 种算法分别计算排名前10 位的热点基因，然后取交集，结合这些候选基因是否处在关键模块中，最终筛选出关键基因。

2 结果

2.1 GO 分析结果 BP 生物学过程功能富集分析结果显示，GO:0033141～富集于STAT 蛋白磷酸化修饰的基因数量有10 个，GO:0002323～富集于免疫反应中自然杀伤细胞活化的基因数量有10 个，GO:0002286～富集于免疫反应中T 细胞活化的基因数量有10 个，见图1。MF 分子功能富集分析结果显示，GO:0005132～参与Ⅰ型干扰素受体结合的基因数量有10 个，GO:0005125～参与细胞因子活化的基因数量有12 个，GO:0005234～参与谷氨酸门控离子通道活化的基因数量有5 个，见图2。CC 细胞组分功能富集分析结果显示，GO:0030054～富集于细胞连接处的基因数量有23 个，GO:0045211～富集于突触后膜上的基因数量有15 个，GO:0030424～富集于轴突的基因数量有14 个，见图3。

图1 生物学过程功能富集结果

图2 分子功能富集结果

图3 细胞组成富集结果

2.2 KEGG 通路富集分析结果 391 个基因主要富集通路包括：hsa04623：细胞质DNA 感觉通路，富集于其上的基因数量有12 个；hsa04622：RLR 信号通路，富集于其上的基因数量有10 个；hsa05320：自身免疫甲状腺疾病，富集于其上的基因数量有9 个，见图4。

图4 KEGG 功能富集结果

2.3 蛋白互作网络分析结果 364 个蛋白发生相互作用，平均节点分数0.852，删除联系较少的节点，其中156 蛋白之间联系程度紧密，见图5。

图5 蛋白互作网络图

2.4 关键模块及关键基因 关键模块中包含11 个基因，分别为TAAR6、DRD2、DRD4、CHRNA7、ZNF804A、DTNBP1、POX2、NRG1、DAO、DISC1、ZDHHC8，其中ZDHHC8 为种子基因，见图6。结合cytohubba 的三种算法，最终获取6 个关键基因，分别为DTNBP1、DAO、DRD2、DISC1、NRG1、ZDHHC8。

图6 关键基因模块图

3 讨论

目前认为与精神分裂症发生密切相关的各种因素中，遗传因素是最具影响力的，得到较多生物学证据支持[4]。此外，在精神分裂症的成因中有一些经典假说，包括多巴胺假说、谷氨酸生化假说、神经发育假说。对精神分裂症生物标志物的研究也大都围绕这些假说开展。本研究发现精神分裂症的病理过程或有免疫因素参与，对精神分裂症编码基因的GO分析发现，大部分基因与免疫反应密切相关，包括以自然杀伤细胞为代表的先天免疫和以T 细胞为代表的适应性免疫。最近有研究指出，精神分裂症的病因与免疫系统调节紊乱密切相关，免疫过程在中枢神经系统的稳态、恢复力和脑储备中起着至关重要的作用[5]。除此以外，有研究指出利用免疫系统治疗或可改善大脑健康，T 细胞分泌IL-4，而IL-4 能刺激星形胶质细胞因子释放，促进小胶质细胞和炎性巨噬细胞的转化，使神经炎性M1 表型向保护性神经元M2 模式转换[6]。本研究还发现这些基因的分子功能大多涉及到细胞因子的活化。Moriss G 等[7]研究表明，活化的细胞因子作为炎症反应的一部分，可以改变5-羟色胺、多巴胺、谷氨酸等神经递质的释放和重摄取。近年来，免疫炎症假说也持续受到关注，来自于临床及临床前研究等多项证据提示，精神分裂症患者血清白细胞介素家族中多种因子、γ-干扰素（IFN-γ）、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）等促炎性细胞因子水平发生改变[8]。此外，本研究对这些基因的通路富集结果还发现TOLL 样受体（TLRs）信号通路似乎在精神分裂症中扮演着重要作用。TLRs主要参与固有免疫的调节，研究发现在精神分裂症早期阶段即可出现TLR 表达异常，并且TLRs 可影响认知功能[9，10]。最近关于抑郁和TLR 的动物研究发现[11]，选择性地阻断TLR2/4 在小胶质细胞中的表达，会抑制小鼠的抑郁行为。这些研究说明TOLL 样受体信号通路参与精神疾病的病理过程，但其究竟如何影响精神疾病的发展还需进一步研究验证。

本研究进一步对391 个编码基因进行蛋白互作分析，筛选精神分裂症相关的关键基因，发现DTNBP1、DAO、DRD2、DISC1、NRG1、ZDHHC8 与 精神分裂症具有较高的相关性，其中DRD2 和DISC1是目前公认的精神分裂症的易感基因[12，13]。本研究发现NRG1 也和精神分裂症密切相关，与文献结果相一致，最近研究发现NRG1 基因表达水平与精神疾病患病风险有关[14]，李婷等[15]则发现首发精神分裂症患者血清NRG1 与认知功能相关。本研究发现DAO 基因也是参与精神分裂症发生发展的关键基因，有文献报道DAO 基因编码的D-氨基酸氧化酶在精神分裂症的病理机制中发挥作用[16]，并且其基因型与精神分裂症及神经认知缺陷相关[17]，而目前研究不足以突出DAO 对精神分裂症的重要性，显然后续需要对DAO 基因进行更深入的研究。目前对于本研究结果中的DPNBP1 基因和精神分裂症关系文献报道还比较少，但已有文献支持DPNBP1 与精神分裂症患者背外侧前额叶皮层树突形成有关，并且其基因多态性与持续注意和固定转移有关[18，19]。另外本研究发现关键模块中的ZDHHC8 是种子基因，与其他的编码蛋白都能产生相互作用。然而，现有对ZDHHC8 的研究只能证实它与精神分裂症患者皮质体积有关[20]，针对巴西人的研究发现它与精神分裂症易感基因有关[21]。早年有报道ZDHHC8 单核苷酸多态性rs175174 与22q11 缺失综合征或精神分裂症的精神病学特征无关[22]，这或许导致后来研究未再对ZDHHC8 引起重视。结合本研究结果，推测ZDHHC8 可能是通过与精神分裂症其他易感基因发生作用，但对此推论需要后续更多的证据支持。

综上所述，免疫炎症反应和精神分裂症的病理机制密切相关，其中TOLL 样受体信号通路和NRG1 信号通路值得关注，而关键基因DTNBP1 和ZDHHC8 与精神分裂症的直接关系还有待进一步研究。