含水量和添加剂对黄梁木叶青贮发酵品质的影响

郭香，陈德奎，陈娜，李云，陈晓阳*，张庆*

（1.华南农业大学林学与风景园林学院，广东木本饲料工程技术研究中心，广东省森林植物种质创新与利用重点实验室，广东广州510642；2.华南农业大学动物科学学院，广东 广州510642；3.北京林业大学生物科学与技术学院，北京100083）

黄梁木（Neolamarckia cadamba）原名团花（Anthocephalus chinensis），为茜草科（Rubiaceae）半落叶常绿高大乔木，广泛分布于热带、亚热带地区。它的特点是蛋白质含量高，增长快，产量大，在良好的环境下，可以在10年内实现全面增长，因此，它有“奇迹树”和“宝石树”的称号。黄梁木通常含有一些抗营养成分，如单宁、皂苷、多酚，这些成分会干扰胰蛋白酶和糜蛋白酶等消化酶的功能。为了最大限度地提高黄梁木的营养质量并获得更广泛的接受，这些抗营养因子可以通过青贮得到有效控制。青贮是一种传统的牧草和谷物保鲜方法，旨在为家畜提供全年可得的营养适口的饲料。纤维素酶（cellulase，C）在青贮期间的应用被认为是一种直接促进纤维降解以释放可发酵底物供乳酸菌使用的方法［1］，并通过降低pH来改善发酵质量。同时，植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum，LP）作为一种有效的促进剂，可以促进乳酸发酵［2］。此外，乳酸菌接种剂和纤维素酶的联合使用对青贮质量显示出协同效应［3］。青贮原料本身的含水量会影响发酵过程和青贮品质，王成等［4］研究表明，70%含水量对辣木（Moringa oleifera）叶的青贮发酵品质有明显的改善作用。尽管已经进行了大量研究乳酸菌和纤维素酶对玉米（Zea mays）、牧草和全株青贮的影响，但有关黄梁木叶青贮的研究很少，并且含水量对黄梁木叶青贮的影响尚不清楚。在此基础上，研究了使用植物乳杆菌和纤维素酶对不同含水量的黄梁木叶青贮的微生物种群、发酵品质、纤维和蛋白质组分以及单宁含量的影响，以期为黄梁木叶的青贮调制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黄梁木种植于华南农业大学跃进试验田（北纬23°19′，东经113°34′），人工采集黄梁木叶片。乳酸菌（LP）是从辣木青贮中筛选出来的，并根据Zhang等［3］的生理生化试验和16S-rRNA测序方法进行了鉴定，将乳酸菌细胞与脱脂牛奶混合，冷冻干燥，制备的乳酸菌粉末在使用前对乳酸菌数量进行了计数。纤维素酶来源于里氏木霉（Trichoderma reesei），具有不低于10000 U·g-（1pH 5.5，37℃）的羧甲基纤维素酶活性，以及一定的β-葡聚糖酶和淀粉酶活性（湖南盛东生物科技有限公司，湖南岳阳）。

1.2 试验设计

采用双因素完全随机设计，2×4（含水量×添加剂）因子处理结构。因素一为含水量，分两个水平，75%（W1），60%（W2）；因素二为添加剂，添加6.00 log10cfu·g-1鲜样（fresh matter，FM）植物乳杆菌（LP）、120 U·g-1FM纤维素酶（C）、6.00 log10cfu·g-1FM植物乳杆菌和120 U·g-1FM纤维素酶（LP×C）、不添加为对照组（CK）。2019年7月，将采集后的新鲜黄梁木叶片用手持干草切割机切成2~3 cm左右的长度，将添加剂溶解在10 mL蒸馏水中，用微型喷雾器喷洒在叶片上，对照组喷洒10 mL蒸馏水。混合均匀后装入聚乙烯塑料袋（20 cm×30 cm），用食品真空封口机封口。每个处理6袋，室温（约30℃）贮藏60 d（2个含水量×4个处理×6个重复，共48袋）。发酵60 d后，每两袋混合取样，原料和青贮样品一式两份采用相同试验方法对发酵质量、微生物种群和化学成分进行分析。

1.3 试验方法

1.3.1 发酵质量和微生物种群的评价 样品（20 g）用蒸馏水（180 mL）在搅拌机中搅拌1 min，然后用4层纱布及定性滤纸过滤得到的滤液测定p H值（PHS-3C，上海雷磁）［5］。浸提液经0.22μm孔径的滤膜过滤得到滤液，采用岛津GC-14型高效液相色谱仪（Shodex Rspak KC-811s-DVB gel column色谱柱，SPD-M 10AVP检测器，日本）测定了乳酸（lactic acid，LA）、乙酸（acetic acid，AA）和丙酸（propionic acid，PA）含量，流动相为3 mmol·L-1HClO4，流速为1.0 mL·min-1；柱温箱50℃；检测波长为210 nm；进样量为5μL［6］。把黄梁木青贮料混合均匀之后称重取样放入65℃恒温烘箱中48 h，计算烘干前后的重量比值得出干物质（dry matter，DM）。采用蒽酮比色法测定水溶性碳水化合物（water-soluble carbohydrate，WSC）：制作葡萄糖标准曲线，将样品煮沸10 min，冷却过滤定容，经吸取摇匀后加入蒽酮，在620 nm波长下比色测定吸光度计算可得。每个样品20 g用180 mL无菌生理盐水混合均匀逐级稀释，利用平板计数法进行微生物数量的测定，用MRS（DeMan Rogosa Sharpe）琼脂培养基和结晶紫中性红胆盐琼脂在30℃培养2 d后对乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）和大肠杆菌（coliform bacteria，CB）计数，用孟加拉红培养基在28℃培养3~5 d后对酵母菌和霉菌进行计数［7］。

1.3.2 化学成分分析 使用全自动凯氏定氮仪（K-9860，中国北京）对样品进行总氮分析，总氮乘以因子6.25计算粗蛋白（crude protein，CP）［8］含量。氨态氮（ammonia nitrogen，NH3-N）、游离氨基酸（free amino acid，FAA）的测定按Broderick等［9］的方法进行。按照Licitra等［10］的方法测定蛋白质组成，包括非蛋白氮（non-protein nitrogen，NPN）和真蛋白（true protein，TP）。使用范氏纤维法测定中性洗涤纤维（neutral detergent fiber，NDF）和酸性洗涤纤维（acid detergent fiber，ADF）含量［11］。按照Harinder［12］的Folin-Ciocalteu比色法测定总酚（total phenol，TP）、简单酚（simple phenol，SP）和水解单宁（hydrolysable tannin，HT）含量，其中水解单宁由总酚减去简单酚可得，按照Coblentz等［13］的方法测定缩合单宁（condensed tannin，CT）含量。

1.4 数据统计与分析

微生物含量计数（乳酸菌、大肠杆菌、酵母菌和霉菌）换算成log10，结果以鲜重表示。采用SPSS 19.0进行了双因素方差分析，两个因素互作显著时用邓肯极差法进行多重比较，其中以P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 青贮前黄梁木叶的特性

鲜黄梁木叶干物质含量约为27.69%（表1），粗蛋白含量约12.48%DM，水溶性碳水化合物含量低至4.49%DM，中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维分别为30.84%DM和21.66%DM。菌群方面，附生乳酸菌、酵母菌和大肠杆菌分别为4.48、4.19和5.59 log10cfu·g-1FM，未检出霉菌。总酚和简单酚含量分别为5.62%DM和1.15%DM，水解单宁和缩合单宁含量分别为4.47%DM和1.72%DM。

表1 青贮前黄梁木叶的特性Table 1 The characteristic of the pre-ensiled N.cadamba leaves

2.2 黄梁木叶青贮的微生物特性和发酵品质

乳酸是主要的发酵产物（表2）。60%含水量处理的干物质含量，pH值和乳酸菌数量显著升高（P<0.05），显著（P<0.05）降低了乙酸的含量。添加LP和LP+C显著降低了60%含水量处理的pH值（P<0.05），但其乳酸含量显著（P<0.05）高于对照。60%含水量处理下添加LP酵母菌数量显著降低（P<0.05），添加LP+C的中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维都显著降低（P<0.05）。然而，在所有青贮样品中的丙酸都低于可检测的水平，大肠杆菌数量小于2.00 log10cfu·g-1FM。方差分析结果表明，不同含水量处理对干物质、pH值、乳酸菌、酵母菌、乳酸、乙酸等有极显著影响（P<0.01），对中性洗涤纤维有显著影响（P<0.05），添加剂对各个指标（干物质、大肠杆菌、乙酸、丙酸除外）均有极显著影响（P<0.01），二者的交互作用对乳酸有极显著影响（P<0.01），对乙酸有显著影响（P<0.05）。

表2 含水量和添加剂对青贮60 d后黄梁木叶的发酵品质和微生物群落的影响Table 2 Effect of moisture and additives on fermentation characteristics and microbial populations of N.cadamba leaves silage after 60 days ensiling

2.3 黄梁木叶青贮的单宁含量

黄梁木叶青贮60 d后（表3），添加LP+C下75%含水量的总酚、简单酚、水解单宁和缩合单宁含量均显著（P<0.05）低于60%含水量处理。方差分析结果表明，含水量处理对总酚、简单酚、水解单宁和缩合单宁含量有极显著影响（P<0.01），添加剂和两者的交互作用仅对缩合单宁含量有显著影响（P<0.05），即添加C和LP+C下75%含水量处理的缩合单宁含量显著（P<0.05）低于60%含水量处理，添加LP和LP+C显著（P<0.05）降低了75%含水量处理的缩合单宁含量。

表3 含水量和添加剂对青贮60 d后黄梁木叶的单宁含量的影响Table 3 Effect of moisture and additives on tannin contents of N.cadamba leaves silage after 60 days ensiling

2.4 黄梁木叶青贮的氮组分

添加C和LP+C显著（P<0.05）提高了75%含水量处理的粗蛋白含量（表4），与75%含水量处理相比，60%含水量处理下仅添加LP和C显著（P<0.05）提高了氨态氮含量。LP和LP+C提高了75%含水量处理的真蛋白含量，也降低了60%含水量处理的非蛋白氮含量，但差异不显著。方差分析结果表明，含水量处理对氨态氮有极显著影响（P<0.01）；添加剂对粗蛋白有极显著影响（P<0.01），对真蛋白和游离氨基酸有显著影响（P<0.05）；二者的交互作用对游离氨基酸有显著影响（P<0.05）。

表4 含水量和添加剂对青贮60 d后黄梁木叶的氮组分的影响Table 4 Effect of moistur e and additives on nitrogen fr actions of N.cadamba leaves silage after 60 days ensiling

3 讨论

鲜黄梁木叶的乳酸菌数量低于5.00 log10cfu·g-1FM。因此，添加乳酸菌接种剂可能有助于提高黄梁木叶青贮的发酵质量。此外，黄梁木叶的水溶性碳水化合物含量较低，仅为4.49%DM，通过添加从作物中释放额外糖分的纤维素酶提高青贮中水溶性碳水化合物含量，进而提高青贮发酵品质［14］。

青贮60 d后，75%和60%含水量处理黄梁木叶干物质含量分别为23.59%和38.99%。含水量处理组对p H值、乳酸菌和酵母菌计数、乳酸、乙酸含量均有极显著影响。当饲料水分太低时，将会直接抑制微生物发酵，而且由于空气难以排净，易引起霉变；然而，当水分过高时，由于腐败微生物的存在，腐败问题变得严重，青贮的最适含水量取决于原料和微生物接种量。在本研究中，75%含水量处理下p H值、酵母菌数量显著降低，乳酸、乙酸等有机酸含量显著升高。本研究结果表明，75%含水量条件下进行青贮可能是黄梁木叶贮存的有效途径。

pH值是评价青贮发酵程度和青贮品质的重要参数。在本研究中，所有处理的pH值均小于4.2，表现出较好的青贮品质，这是因为大多数腐败微生物通常在p H<4.2时被抑制。添加LP和LP+C可显著降低p H值，这可能是因为在青贮阶段添加乳酸菌接种剂，确保了快速而有力的发酵，从而加快了乳酸的积累，降低了青贮早期阶段的pH值，并改善了牧草保存［15］。这也可以解释添加LP和LP+C显著增加乳酸含量的原因。此外，添加C和LP+C显著降低了中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的含量，纤维素酶的添加使纤维含量得到有效降低。乳酸菌接种剂对水溶性碳水化合物含量高的青贮牧草更有效［16］，说明应用纤维素酶提高黄梁木叶青贮中的水溶性碳水化合物含量有利于青贮品质的改善。因此，植物乳杆菌与纤维素酶配合使用，对提高黄梁木叶青贮品质有进一步的积极作用。

单宁是木本植物原料中的一种抗营养因子，主要表现为减少动物摄食量，降低营养物质的生物利用率，并产生毒性效应［17］。相反，单宁对动物的生长也具有多种生理活性，如止血、抑制微生物、抗过敏、抗突变和抗衰老［18］。本研究结果表明，青贮60 d后75%含水量处理组与黄梁木原料相比水解单宁和缩合单宁的含量分别降低了73%和41%，并且添加了LP和LP+C之后75%含水量处理组的缩合单宁含量显著降低，但是对总酚、简单酚和水解单宁含量无明显影响，添加LP+C的75%含水量处理的总酚、简单酚、水解单宁和缩合单宁相比于60%含水量处理显著降低，这可能是由于青贮饲料可能通过影响微生物的增殖而诱导更多的单宁酶分泌［19］，进而降低单宁含量。董文成等［20］研究表明，当牧草缩合单宁高于5.0%DM时，畜禽采食量下降，瘤胃发酵受到抑制，显著降低了包括蛋白质在内的几乎所有养分消化率。一般来说，不高于1.5%DM的单宁对猪和肉鸡生长无不良影响［21］。青贮60 d后所有处理的缩合单宁都低于1.2%DM，在安全水平以下，不影响适口性和消化率。

本试验所用黄梁木原料的粗蛋白含量相对较高，约为12.48%，与黄梁木叶青贮之后差异不大，符合我国二级饲料质量标准，可作为高蛋白饲料利用。在本研究中，含水量和添加剂对蛋白质的降解没有影响，说明在青贮过程中，黄梁木叶具有较好的蛋白质保存能力，这可能与其叶片中含有丰富的酚类物质有关。多酚能够与蛋白质结合，形成多酚-蛋白质复合物，从而减少植物材料分解过程中氮的释放［22］。Jones等［23］还提供了多酚氧化酶可能参与红三叶（Trifolium pratense）青贮期间蛋白质保护机制的证据。

相比于黄梁木，还有很多类似的热带、亚热带青贮饲料正在开发中，例如辣木、甘蔗（Saccharum officinarum）、香蕉（Musa nana）茎叶等，针对目前青贮饲料的供应不足，应多关注其他潜在的热带、亚热带青贮饲料。庞家满等［24］利用辣木叶饲喂生长猪，研究发现辣木叶具有较高的营养价值，适合作为生长猪的蛋白质饲料原料。

4 结论

75%含水量处理通过增加乳酸含量，降低p H值、单宁含量，对青贮品质有一定的改善作用。添加纤维素酶可降低中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量，添加植物乳杆菌通过降低青贮饲料的pH值、酵母菌数，提高乳酸和粗蛋白含量来改善青贮品质，并与纤维素酶联合使用效果进一步增强。这些添加剂对单宁含量和氮组分影响不大，在青贮过程中，黄梁木叶蛋白质几乎没有降解。本研究结果表明，青贮在75%含水量时的黄梁木叶更有利于青贮品质的提高，但其最适含水量的确定还有待进一步研究。添加剂对青贮品质也有一定的改善作用，植物乳杆菌与纤维素酶配合使用效果较好，但其效果尚需进一步试验证实。