基于生物信息学分析miR-130b-3p在肾透明细胞癌中的表达、靶基因及预后价值①

邹元章 卢俅 陈兵海（江苏大学附属医院泌尿外科，镇江212001）

miRNA是长度约为22个碱基的一类非编码单链小分子RNA，可通过结合mRNA靶基因的3'非编码区（3'UTR）导致靶标降解或抑制该mRNA翻译［1］。miRNA通过负调节细胞过程相关基因参与细胞周期调节、应激反应以及细胞分化、增殖、侵袭、迁移和凋亡等过程［2-4］。因此，miRNA涉及细胞内信号转导通路的多个方面。近年，miRNA在人类疾病尤其肿瘤中的作用不断被揭示，研究已表明大量miRNA在肿瘤组织中异常表达，并在肿瘤发生发展过程中起重要作用［5-6］。

miR-130b-3p（曾为hsa-miR-130b）位于人染色体22q11.22区，研究显示，miR-130b-3p在乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌等多种肿瘤中表达异常，并参与肿瘤发展，有望成为以上肿瘤治疗靶点及预后生物标志物［7-10］。此外，研究报道，miR-130b-3p在肾透明细胞癌（renal clear cell carcinoma，KIRC）组织和细胞系中表达上调，且可促进肾癌细胞迁移、增殖，抑制其凋亡，因而有望成为KIRC的诊断标志物和治疗靶点［11］。但miR-130b-3p在KIRC中的调控靶基因和预后价值尚未明确。因此，本研究通过生物信息学方法分析miR-130b-3p在KIRC中的表达水平、靶基因及预后意义，为进一步探索miR-130b-3p在KIRC中的作用机制和临床应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 miR-130b-3p的注释信息查询miRBase数据库是在线开放的microRNA序列和注释资源库，其最新版本包含来自271个生物的miRNA序列，包括38 589个miRNA前体和48 860个成熟体［12］。采用miRBase数据库查询miR-130b-3p在不同生物中的序列和注释信息。

1.2 miR-130b-3p在肿瘤组织中的表达分析db-DEMC2.0数 据 库（https：//www.picb.ac.cn/db-DEMC/）整合了GEO和TCGA数据库的209个数据集，储存了在36种肿瘤中差异表达的2 224个miRNA。UCSC（https：//genome.ucsc.edu/）数据库包含TCGA和GDC的肿瘤数据，可提供数据下载和实现数据在线可视化。本研究采用dbDEMC2.0数据库分析miR-130b-3p在人类肿瘤组织和正常组织中的表达情况；从UCSC数据库下载KIRC及相应正常样本的miRNA表达数据，提取miR-130b-3p的表达数据并分析其表达差异。

1.3 miR-130b-3p的靶基因预测UALCAN（http：//ualcan.path.uab.edu/）数据库包含的预测靶基因源于microRNA.org平台和miRDB数据库，StarBase3.0（http：//starbase.sysu.edu.cn/）数据库获得的预测靶基因来源于microT、miRanda、miRmap、PITA、RNA22、PicTar、TargetScan等数据库或平台。通过UALCAN和StarBase3.0数据库获取miR-130b-3p在KIRC中的预测靶基因，其中UALCAN数据库选择靶基因条件为down-reg，StarBase3.0数据库选择与miR-130b-3p表达负相关的基因，取两者交集作为其靶基因集合用于后续分析。

1.4 miR-130b-3p靶基因的功能和通路富集分析Metascape整合了GO、KEGG、UniProt和Drug-Bank等多个权威数据库的数据资源，是多功能的基因功能注释分析工具［13］。将miR-130b-3p靶基因集导入Metascape，设置人类基因组作为背景基因，其他选择默认进行GO和KEGG富集分析，KEGG分析结果采用R软件（3.6.2）以散点图展示。

1.5 miR-130b-3p预后分析Kaplan-Meier Plotter（https：//kmplot.com/）是基于GEO、EGA和TCGA临床样本分析mRNA、lncRNA、miRNA的预后常用的在线平台。本研究采用Kaplan-Meier Plotter分析miR-130b-3p在KIRC患者中的预后价值。

2 结果

2.1 miR-130b-3p在染色体的定位和物种间的保守性miRBase数据库查询结果如表1，miR-130b-3p位于人染色体22q11.22区，其碱基序列为5′-CAGUGCAAUGAUGAAAGGGCAU-3′；与山羊、小家鼠、猪、猕猴等共11个物种序列进行比对，发现miR-130b-3p序列在11个物种中完全一致，表明miR-130b-3p在物种间具有高度保守性。

表1 不同物种miR-130b-3p成熟体序列Tab.1 Mature sequence of miR-130b-3p in different species

2.2 miR-130b-3p在人类肿瘤和KIRC组织中的表达dbDEMC2.0数据库分析miR-130b-3p在各肿瘤中的表达情况，结果显示，miR-130b-3p在肾癌、乳腺癌等多种肿瘤中表达上调，而在淋巴瘤、胰腺癌等肿瘤中表达下调（图1A）；肿瘤分级比较结果显示，miR-130b-3p在肾癌高分级与低分级中的差异最为显著（图1B）。进一步分析miR-130b-3p在KIRC的表达，结果显示，miR-130b-3p在KIRC组织较正常组织表达上调，且随肿瘤分级增加而升高，差异具有统计学意义（图1C、D）。

图1 miR-130b-3p在人类肿瘤和KIRC中的表达Fig.1 Expression of miR-130b-3p in human cancers and KIRC

2.3 miR-130b-3p在KIRC中的靶基因UALCAN数据库获得195个miR-130b-3p在KIRC中的预测靶基因，StarBase3.0数据库获得1 224个预测靶基因，取两者交集得到靶基因集，包含87个靶基因，其中NR3C2、PAK6和HSPA8为免疫相关基因，HSPA8、RAB5A、ITPR1为自噬相关基因（表2）。

表2 miR-130b-3p在KIRC中的靶基因集Tab.2 Target gene set of miR-130b-3p in KIRC

2.4 miR-130b-3p靶基因的GO功能和KEGG通路富集分析GO功能富集分析结果显示，miR-130b-3p靶基因在KIRC主要涉及细胞自噬、顶树突发育、磷脂酰肌醇生物合成过程、肌动蛋白细胞骨架形成等生物过程（图2A）；KEGG通路富集分析显示，miR-130b-3p靶基因参与甲状腺激素合成信号通路、肌动蛋白细胞骨架调节信号通路以及Ras信号通路等（图2B）。

图2 miR-130b-3p靶基因GO和KEGG富集分析Fig.2 GO and KEGG enrichment analysis of miR-130b-3p target genes

2.5 miR-130b-3p与KIRC患者预后不良相关生存分析结果显示，miR-130b-3p表达与KIRC患者预后显著相关，miR-130b-3p高表达患者总生存期明显低于低表达患者（图3），表明miR-130b-3p有望成为KIRC患者的预后标志物。

图3 miR-130b-3p在KIRC中的Kaplan-Meier生存曲线Fig.3 Kaplan-Meier curve of miR-130b-3p in KIRC

3 讨论

本研究通过生物信息学方法发现miR-130b-3p序列在物种间具有高度保守性，提示miR-130b-3p在物种进化和调控靶基因中可能起关键作用。另外，对miR-130b-3p在肿瘤组织中的表达分析发现，miR-130b-3p在肾癌、乳腺癌等多种肿瘤中表达上调，而在淋巴瘤、胰腺癌等肿瘤中表达下调，提示miR-130b-3p在不同肿瘤中的作用可能不完全相同，甚至相反。文献报道，miR-130b-3p以癌症类型依赖性方式具有致癌和抑癌功能，而在KIRC中起致癌作用，与本研究结果一致［7，11］。此外，miR-130b-3p在KIRC高分级中的表达明显高于低分级，提示miR-130b-3p可能参与KIRC进展。已有文献报道，miR-130b-3p可能促进KIRC细胞生长而导致该肿瘤进展，且miR-130b-3p可引发癌细胞系786-O对舒尼替尼耐药［14］。

miRNA通过与mRNA靶基因结合并抑制其表达或翻译过程而参与人类疾病（包括肿瘤）发生发展［15］。1个miRNA可靶向作用于数百或上千个靶基因，同样，1个靶基因也可与多个miRNA相互作用［16］。本 研 究 通 过 数 据 库 获 得miR-130b-3p在KIRC中的预测靶基因87个，通过Metascape对靶基因在KIRC中的GO生物学过程和KEGG信号通路进行富集分析，发现miR-130b-3p靶基因集主要涉及细胞自噬、顶树突发育、磷脂酰肌醇生物合成、肌动蛋白细胞骨架形成等生物过程和甲状腺激素合成信号通路、肌动蛋白细胞骨架调节信号通路以及Ras信号通路等。

miR-130b-3p在肿瘤组织中表达异常，并与肿瘤患者不良预后显著相关，有望成为肿瘤的预后标志物。如，ZHAO等［9］检测miR-130b在52对胰腺癌组织和癌旁组织的表达，结果显示，miR-130b在癌组织中表达明显低于癌旁组织，生存分析表明miR-130b低表达与胰腺癌患者不良预后相关。而COLANGELO等［17］和WANG等［18］研究表明，miR-130b在结直肠癌和肝细胞癌中高表达，并与患者不良预后相关。本研究采用Kaplan-Meier Plotter平台的KIRC患者临床数据，对miR-130b-3p进行生存分析，结果显示，miR-130b-3p在KIRC高表达与患者不良预后相关，表明miR-130b-3p有望成为KIRC的预后标志物。此外，研究显示，miR-130b-3p在转移性肾上腺皮质瘤中的表达与免疫细胞表达显著相关，而免疫细胞表达也与肿瘤患者预后有关［19］。

综上所述，miR-130b-3p在KIRC发展中具有重要作用；此外，本研究预测了miR-130b-3p在KIRC中的靶基因，为后期深入研究miR-130b-3p在KIRC中的调控机制提供理论依据。