光敏Z亲和肽-碱性磷酸酶重组蛋白的构建及其生物学活性研究①

于晓甜 张晓坤 高晓艺 杨洪鸣 唐金宝（潍坊医学院药学院，潍坊261053）

标记免疫分析技术是将抗原-抗体结合反应的特异性和各种标记物的可测量性相结合的分析技术，标记抗体是该技术中不可或缺的重要试剂［1-2］。目前，基于交联抗体分子内活性氨基酸残基的化学共价偶联技术是抗体标记的主要技术，但由于抗体表面上存在的多个活性位点（如1个IgG分子表面有86个-NH2）都可能参与偶联，一旦偶联反应的氨基酸残基位于Fab端，则影响抗体与抗原的结合，导致标记后抗体的抗原结合活性降低［3-4］。因此，开发一种特异性偶联抗体Fc位点的抗体标记技术，对于保持标记后抗体的抗原结合活性具有重要意义。蛋白A能通过疏水作用结合兔、人及小鼠等多种动物IgG的Fc段，根据这一特性，除广泛应用于动物血清IgG和单克隆抗体纯化外，还被多种标记物（过氧化物酶、碱性磷酸酶、胶体金等）偶联标记用于免疫测定［5-6］。Z亲和肽是源于蛋白A的IgG结合结构域，分子量为7 kD［7-8］。本研究以密码子扩展修饰蛋白质技术（aminoacyl-tRNA synthetase/suppressor tRNA，aaRS/tRNA）将含有光敏基团的非天然氨基酸（4-苯甲酰基-L-苯基丙氨酸，p-benzoylphenylalanine，Bpa）引入Z亲和肽的氨基酸序列，并在其C-端重组引入碱性磷酸酶，构建带光敏基团的ZBpa-AP重组蛋白，利用Z亲和肽与IgG-Fc的亲和特异性以及Bpa的共价键形成能力，实现碱性磷酸酶对抗体Fc位点的共价偶联标记，以期为构建一种新型的酶标抗体奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料pTXB1、pEVOL-pBpF质粒分别购自NEB公司和Addgene公司；Bpa购自广州氪道公司；His-Trap Chelating HP购自Amersham Biosciences公司；超滤离心管（50 kD）购自Millipore公司；兔IgG抗体购自BBI公司；Rabbit anti-goat F（ab′）2片段购自Jackson公司；BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒购自碧云天生物公司；pDAP2质粒及E.coliBL21放于药学专业实验室保存；其他生化及化学试剂为进口或国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 光敏ZBpa-AP融合蛋白表达载体的构建根据GenBank数据库登录的Z亲和肽基因序列（No.M74186），将第17位氨基酸密码子突变为琥珀密码子（UAG），分别在5′及3′端设计NdeI及SalI限制性内切酶酶切位点，上述基因序列委托上海生工生物合成并克隆至pTXB1质粒，构建中间质粒载体pTXB1-ZTAG。根据大肠杆菌碱性磷酸酶基因序列，设计1对引物（上游引物：5′-GCGTCGACATGCCTGTTCTGG-3′；下游引物：5′-CAGGAAGAGCCCTCGAGTTAATG-3′，下划线分别为SalI及XhoI酶切位点），以pDAP2质粒为模板PCR方式获取AP基因并克隆至pTXB1-ZTAG，构建表达载体pZTAG-AP。

1.2.2 光敏ZBpa-AP融合蛋白的表达与纯化pZTAGAP和pEVOL-pBpF共转化至感受态菌E.coliBL21，涂布于含氯霉素（50 mg/L）和氨苄青霉素（100 mg/L）的LB平板37℃下培养12 h。阳性单克隆菌落于含氯霉素（50 mg/L）和氨苄青霉素（100 mg/L）的LB培养基中培养12 h后，以1/50的接种量在LB培养基中37℃培养至OD600nm为0.6～0.8。然后将终浓度为300 mmol/L的Bpa加入到培养基中，并继续生长1 h后，分别加入阿拉伯糖和异丙基β-D-1-硫代吡喃半 乳 糖 苷（IPTG）至 终 浓 度 为0.2%（m/v）和0.5 mmol/L，诱导表达6 h后，离心收集菌体，用含咪唑20 mmol/L的20 mmol/L PBS溶液重悬菌体，反复冻融直至菌液变得黏稠，8 000 r/min离心10 min，取上清。HisTrap Chelating HP纯化目的蛋白，Amicon®Ultra-4（分子截留量50 kD）对咪唑洗脱组分进行超滤浓缩脱盐，12%SDS-PAGE检测。

1.2.3 ZBpa-AP与抗体光激发共价偶联终浓度分别为10µmol/L和50µmol/L的抗体（兔IgG）和ZBpa-AP溶液于石英比色皿中混合，4℃下孵育1 h。混合物置于冰上，365 nm紫外灯照射，并分别在照射时间0 min、30 min、60 min、90 min、120 min取样，12%变性和非变性SDS-PAGE分析偶联效果。

1.2.4 对照实验兔F（ab'）2片段与ZBpa-AP以物质的量比1：5混合，4℃下孵育1 h。365 nm紫外灯于冰上照射120 min，12%变性SDS-PAGE分析。

1.2.5 Western blot将1.2.3项取样样品经12%非变性SDS-PAGE分离后，转至PVDF膜。转膜结束后，经PBST洗涤3～4次后，PVDF膜浸入BCIP/NBT显色液，室温振荡染色，直至出现明显条带。

2 结果

2.1 光敏ZBpa-AP融合蛋白表达载体的构建化学合成第17位突变为TAG的Z亲和肽序列片段经测序后亚克隆至pTXB1质粒获得pTXB1-ZTAG质粒；PCR方式扩增AP基因片段，经测序正确后双酶切插入pTXB1-ZTAG质粒，获得pZTAG-AP表达载体（图1）。

图1 pZTAG-AP质粒图谱Fig.1 Plasmid profile pZTAG-AP

2.2 光敏ZBpa-AP融合蛋白的表达与纯化培养基含有Bpa培养的工程菌与不含Bpa培养的工程菌相比，在56 kD左右出现蛋白条带，与ZBpa-AP融合蛋白理论值相符（图2）。菌体冻融上清流通HisTrap层析柱，300 mmol/L咪唑（20 mmol/L PBS，150 mmol/L NaCl，pH=7.4）洗脱目的蛋白，其电泳纯度可达90%。

图2 12%SDS-PAGE分析目的蛋白的表达及纯化Fig.2 12%SDS-PAGE analysis of expression and purification of target protein

2.3 ZBpa-AP与抗体的光共价偶联结果如图3所示，非还原电泳结果显示，光照产物在IgG抗体上方出现两条带，且随着光照时间的延长，最上方条带着色加深，而抗体及ZBpa-AP蛋白条带变浅，表明越来越多的抗体被两分子ZBpa-AP偶联，凝胶灰度扫描表明约90%的IgG被ZBpa-AP分子共价偶联。还原SDS-PAGE结 果 表 明，ZBpa-AP与IgG重 链（heavy chain，HC）偶联。为进一步考察ZBpa-AP与HC偶联部位，兔F（ab'）2片段与ZBpa-AP按物质的量浓度比1：5混合，4℃下孵育1 h。冰浴条件下UV光照偶联2 h。还原SDS-PAGE结果显示（图4），ZBpa-AP不能偶联F（ab'）2片段。因此，根据ZBpa-AP与IgG、F（ab'）2偶联产物的电泳结果，可证明ZBpa-AP与抗体发生共价偶联的部位是抗体Fc段。

图3 12%非变性与变性SDS-PAGE分析光照产物Fig.3 12% non-reducing and reducing SDS-PAGE analysis of photoconjugation

图4 12%变性SDS-PAGE分析ZBpa-AP与F（ab′）2的光照产物Fig.4 12% reducing SDS-PAGE analysis of ZBpa-AP photoconjugated F（ab′）2 fragment

2.4 Western blot结果显示偶联物条带显色，且随照射时间延长颜色变深，而ZBpa-AP条带随照射时间延长颜色变浅（图5B、D），与考马斯亮蓝染色结果一致（图5A、C），表明偶联物具有碱性磷酸酶活性。

图5 偶联产物的碱性磷酸酶活性分析Fig.5 Activity analysis for alkaline phosphatase of coupling produt

3 讨论

通过基因工程技术构建融合蛋白可避免化学随机偶联标记技术对标记蛋白生物学活性的影响，如蛋白A与标记蛋白（绿色荧光蛋白、碱性磷酸酶及荧光素酶等）构建融合蛋白，能充分保持蛋白A及标记蛋白的生物学活性，提高基于蛋白A免疫分析的特异性与灵敏度［9-11］。然而蛋白A与兔、人、小鼠等动物IgG是可逆性结合，如以蛋白A融合的蛋白应用于人血清疾病标志物检测时，血清中内源性人IgG抗体会竞争性结合蛋白A融合蛋白，干扰测定的准确性［12-13］。如果将蛋白A与抗体的可逆亲和转变为共价偶联，则能突破蛋白A在临床免疫检验的应用瓶颈。光亲和标记技术可实现受体蛋白与配体蛋白之间共价结合，光敏衍生物修饰的配体与受体蛋白生物结合后，再光照激发使光敏衍生物在结合部位与受体蛋白形成共价键［14-15］。以Z亲和肽为亲和配基，研究显示光敏基团在其第17位氨基酸位置时与兔IgG的光共价偶联效率最高［6，16］。本研究中，为实现该融合蛋白与抗体的共价偶联，利用遗传密码扩展技术（aaRS/tRNA）将Z亲和肽的第17位氨基酸替换为光敏基团的Bpa，构建光敏ZBpa-AP融合蛋白。实验结果表明，光敏ZBpa-AP具有IgG-Fc的亲和特性、Bpa的共价结合能力以及碱性磷酸酶的酶学活性，实现了碱性磷酸酶对抗体Fc位点的共价偶联标记，这对于开发基于抗体特异性位点的抗体标记技术具有重要意义。下一步研究重点是该光偶联标记方式对偶联后抗体的免疫学活性以及其对标记免疫分析检测效能的影响。