氨基胍对肺纤维化大鼠MMP-13、TIMP-1及转化生长因子-β1/Smads信号通路的影响①

穆亚敏 黄希 宋志勇（湘潭医卫职业技术学院，湘潭410004）

肺脏纤维化（pulmonary fibrosis，PF）是累及肺间质、肺泡及肺血管的进行性疾病。临床上PF常伴有限制性通气功能受损，导致患者气体交换障碍，呼吸困难，诱发低氧血症，甚至导致患者出现呼吸衰竭，危及生命。PF病理机制尚未阐明，尚无根治手段。研究证实，肺部细胞外基质（extracellular matrix，ECM）骤然大量降解，过度积累，导致间质纤维化［1］。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）及其天然抑制剂组织基质金属蛋白酶抑制物（tissue inhibitors of metalloproteinase，TIMPs）表达失衡是ECM合成与降解失衡的主要原因［2］。WU等［3］研究表明，调节大鼠肺组织TIMP-1表达有助于改善PF症状。转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是器官纤维化病变中公认的关键调控因子。信号转导分子（sma and mad homologues，Smads）是TGF-β1与相应细胞表面的丝/苏氨酸激酶受体结合后，负责将胞膜信号传递至胞核下游重要的介导分子。LEBRUN等［4］研究表明，TGF-β1信号分子被激活是PF的标志性事件。氨基胍是一种具有亲核性能的肼类小分子，可抑制体内蛋白糖基化修饰，是临床上针对糖基化终末产物确切的抑制剂。YOON等［5］研究证实，氨基胍在糖尿病肾病小鼠模型明显抑制肾小球及肾间质纤维化。但氨基胍对PF作用的报道较少。本研究通过建立大鼠PF模型，观察大鼠肺组织中MMP-13及TIMP-1表达，基于TGF-β1/Smads信号通路探讨氨基胍对PF大鼠肺组织的保护作用，为氨基胍临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物SPF级8～10周龄SD雄性大鼠120只，体重200～220 g，购自北京维通利华实验动物有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0011，依照我院实验动物管理办法，室温下标准饲料喂养，自由饮水，分笼（4笼）适应性饲养1周后用于后续实验。本研究经我院实验动物管理伦理委员会批准（2019-032）。

1.1.2 主要试剂氨基胍（20 mg，美国Sigma公司，生产批号：L39964）；博莱霉素（15 mg/只，日本化药株式会社，生产批号：H20090885）；地塞米松（0.75 mg，广东华南药业）；p-Smad2、p-Smad7、MMP-13、TIMP-1抗体、兔抗GAPDH抗体（美国Santa公司）；Western blot试剂盒（德国Rebstock公司）；免疫组化试剂盒、Masson染色试剂盒（南京建成生物有限公司）；HE试剂盒（上海碧云天公司）；蛋白浓度测定试剂盒、化学发光试剂盒（美国Forma公司）。

1.1.3 主要仪器LIOOS600T生物显微镜（日本尼康公司）；Bio-Rad凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；-80℃冰箱（德国维根斯公司）；Leica RM2135组织切片机（德国Leica公司）；高速低温离心机（北京六一仪器厂）。

1.2 方法

1.2.1 造模与分组处理适应性喂养1周后，将大鼠随机分为4组：正常组、模型组、氨基胍干预组（实验组）、阳性对照药地塞米松干预组（对照组），每组30只。模型组、实验组、对照组大鼠一次性气管滴注4 mg/ml博莱霉素氯化钠（0.9%）溶液构建PF模型（1.25 ml/kg）［6］，正常组大鼠滴注等剂量等浓度氯化钠溶液。滴注完毕后实验组、对照组大鼠每日分别腹腔注射1 ml氨基胍溶液（20 mg/kg）和1 ml地塞米松溶液（20 mg/kg），正常组、模型组分别腹腔注射等剂量生理盐水。注射完毕后，所有大鼠正常饮食，自由饮水。药物干预28 d后心脏穿刺处死大鼠，打开胸腔无菌取出肺组织，-80℃保存待测。

1.2.2 各组大鼠支气管灌洗液（BALF）标本采集药物干预28 d后，麻醉大鼠，心脏穿刺处死大鼠，分离完整气管，并在左主支气管进行气管插管，丝线结扎，PBS冲洗3次，收集各组大鼠BALF，离心，取上清，-80℃保存待测。细胞沉淀经PBS缓冲液重悬，均匀铺于载玻片，Wright Giemsa染色，显微镜下观察总细胞和嗜中性粒细胞数。

1.2.3 肺组织湿重/干重（W/D）比例测定取各组10%大鼠肺组织，肉眼观察各组大鼠肺组织解剖病理变化，无菌清洗，无菌吸水纱布吸干。称重（湿重W），60℃烘箱中放置48 h，称重（干重D），计算W/D。

1.2.4 HE染色观察各组大鼠肺组织病理学改变取各组10%肺组织标本，多聚甲醛固定24 h，包埋，切片，HE染色，光镜下观察各组肺组织病理变化。

1.2.5 Masson染色观察各组大鼠肺组织纤维化改变取各组大鼠10%肺组织，生理盐水冲洗10 min，中性甲醛溶液固定，石蜡切片，常规脱蜡，无菌水清洗10 min，Masson复合液染色15 min，0.2%醋酸溶液清洗，5%磷钨酸漂洗10 min，0.2%醋酸溶液清洗3次，2%苯胺蓝复染5 min，无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶固定，倒置荧光显微镜下观察肺组织标本形态学变化。Masson染色后，肺肌细胞、红细胞被染成红色，而分布在细胞间隙的胶原纤维被染成蓝色，胞核呈蓝褐色［7］。

1.2.6 qRT-PCR检测各组大鼠肺组织TGF-β1、Smad2、Smad7 mRNA表达取各组大鼠10%肺组织，常规提取肺组织细胞总RNA，测定RNA浓度，同时进行RNA完整性测定［8］。采用多基因梯度进行qRT-PCR反应，设计目标蛋白mRNA引物序列，反应过程以及条件：75℃预变性120 s；90℃变性5 min；60℃退火60 s；72℃延伸30 s；40个循环。以U6为内参，U6 F：5′-GATCTGCTATCCCACGGA-3′，R：5′-CTGACCAGCCATAGCCAGA-3′，TGF-β1 mRNA F：5′-GGAGCACTGAACGCACAGA-3′，R：5′-CTACGGAGATTCAAACTCGTG-3′，Smad2 mRNA F：5′-ATGCCGAGGAACAGATATCTA-3′，R：5′-CGACCATATCGCACGAGTGCA-3′，Smad7 mRNA F：5′-ATATCGGCCTATACTCGAT-3′，R：5′-CAGGATGCTAGTCGTAATGTA-3′。以2-ΔΔCt表示目的基因相对表达。

1.2.7 免疫组化检测各组大鼠肺组织MMP-13和TIMP-1表达取各组大鼠10%肺组织，10%甲醛固定，包埋，切片，脱蜡，PBS缓冲液修复2 h，室温下3%过氧化氢浸泡，封闭，分别加一抗（1：1 000）4℃孵育过夜，次日PBS洗涤，分别加二抗（1：1 000），室温孵育30 min，PBS洗涤。加适量DAB孵育5 min，去离子水终止反应，苏木素复染5 min，无菌水冲洗，梯度乙醇脱水2 h，无菌滤纸吸净表面残存液体，中性树胶封片，显微镜下观察并拍照，随机取3个区域，计数视野中总细胞数以及阳性染色细胞数。目标蛋白表达率（%）=阳性染色细胞数/视野中总细胞数×100%。

1.2.8 Western blot检测各组大鼠肺组织TGF-β1、p-Smad2和p-Smad7表达取各组大鼠10%肺组织，常规裂解，冰浴5 min，离心，取上清，BCA测定蛋白浓度，凝胶电泳分离蛋白，转至PVDF膜，5%TBST液室温封闭2 h，加入一抗稀释液（1：1 000）4℃孵育过夜。次日冲洗干净，加入二抗（1：10 000）室温孵育，DAB显色，以GAPDH为内参，E-Gel Imager凝胶成像仪检测，计算目的蛋白相对表达。

1.3 统计学分析采用SPSS16.0软件进行统计学分析，采用Graphpad5.01软件作图，组间比较采用t检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠、BALF中嗜中性粒细胞、总细胞数以及肺组织W/D比较与正常组相比，模型组大鼠BALF中嗜中性粒细胞和总细胞数及肺组织W/D明显升高（P＜0.05），与模型组相比，实验组、对照组大鼠BALF中嗜中性粒细胞和总细胞数以及肺组织W/D明显降低（P＜0.05），实验组和对照组差异无统计学意义（P＞0.05，图1）。

图1 各组大鼠BALF中嗜中性粒细胞和总细胞数及肺组织W/DFig.1 Number of neutrophils and total cell number in BALF and W/D of lung tissues of rats in each group

2.2 各组大鼠肺组织解剖学、组织病理学及纤维化比较各组大鼠肺组织解剖学改变结果显示，正常组大鼠肺组织颜色呈粉红色，表面光滑，质地柔软、饱满富有弹性，肺组织表面无出血点，无斑点，被膜无紧张，切面无渗出；模型组大鼠肺组织表面皱缩严重，取出肺组织时有泡沫样黏液流出，肺组织明显肿大，肺组织呈灰白色，表面有片状淤血，出血点较多，触摸时有明显结节，同时被膜明显僵硬，切面有渗出；实验组、对照组大鼠肺组织较模型组有明显好转，出血点和淤血区域明显减少。HE染色结果显示，正常组大鼠肺组织结构完整，无充血、扩张及出血现象，肺泡腔结构清晰，肺泡壁厚度均匀，无增宽、渗出等，肺泡间隔及各级支气管管腔内无水肿、无分泌物渗出、无炎症细胞浸润等。与正常组相比，模型组大鼠肺泡出现弥漫性病理实变，肺泡壁厚度不均一，明显变小，间隔明显增宽，腔内大量炎症细胞填充，肺间质中出现大量成纤维细胞。实验组、对照组大鼠肺组织病理症状有所缓解，肺泡大小均一，腔内少量水肿液填充，炎症细胞明显减少，间质内成纤维细胞数有所减少。Masson染色结果显示，正常组大鼠肺组织结构清晰，视野内未见蓝绿色胶原纤维沉积出现。与正常组相比，模型组大鼠肺组织间质中可见成片蓝绿色胶原纤维沉积，分布均匀。实验组、对照组大鼠肺组织间质中蓝绿色胶原纤维沉积分布区域明显减少（图2）。

图2 肺组织病理变化Fig.2 Pathological changes of lung tissue

2.3 免疫组化检测各组大鼠肺组织MMP-13和TIMP-1表达免疫组化结果显示，与正常组相比，模型组大鼠肺组织TIMP-1表达明显升高，MMP-13表达明显降低（P＜0.05），与模型组相比，药物干预后，实验组、对照组大鼠肺组织TIMP-1表达明显降低，MMP-13表达明显升高（P＜0.05）。实验组和对照组差异无统计学意义（P＞0.05，图3）。

图3 免疫组化检测TIMP-1、MMP-13表达（×400）Fig.3 Immunohistochemistry detection of expressions of TIMP-1 and MMP-13（×400）

2.4 qRT-PCR检测各组大鼠肺组织TGF-β1、p-Smad2和p-Smad7 mRNA表 达RT-PCR检 测 结 果显示，与正常组相比，模型组大鼠肺组织TGF-β1、Smad2 mRNA表达明显升高（P＜0.05），Smad7 mRNA表达明显降低（P＜0.05），与模型组相比，药物干预后，实验组、对照组大鼠肺组织TGF-β1、Smad2 mRNA表达明显降低（P＜0.05），Smad7 mRNA表达明显升高（P＜0.05）；实验组和对照组差异无统计学意义（P＞0.05，图4）。

图4 qRT-PCR检测TGF-β1、Smad2和Smad7 mRNA表达Fig.4 TGF-β1，Smad2 and Smad7 mRNA expressions detected by qRT-PCR

2.5 Western blot检测各组大鼠肺组织中TGF-β1、p-Smad2和p-Smad7表达Western blot结果显示，与正常组相比，模型组大鼠肺组织TGF-β1、p-Smad2表达明显升高，p-Smad7表达明显降低（P＜0.05），与模型组相比，实验组和对照组大鼠肺组织TGF-β1、p-Smad2表达明显降低，p-Smad7表达明显升高（P＜0.05）；实验组和对照组差异无统计学意义（P＞0.05，图5）。

图5 各组大鼠肺组织中TGF-β1、p-Smad2和p-Smad7表达Fig.5 Expressions of TGF-β1，p-Smad2 and p-Smad7 in lung tissues of rats in each group

3 讨论

PF是一种弥漫性致死率极高的肺间质疾病，其基本病理实质为多种因素（肿瘤、持续性辐射、放疗与化疗等）诱发的肺部损伤导致肺部细胞ECM过度积累，肺组织结构被破坏，影响患者肺功能，尚无快速有效的治疗手段［9］。因此阐明PF的分子机制，及时降解ECM，对临床治疗PF具有重大意义。

氨基胍分子式为CH6N4，是一种肼类小分子，具有1个亲核羰基基团，可导致多种氧化还原酶失活，在糖尿病肾病及心脏移植中广泛应用。近年研究发现，氨基胍对器官纤维化病变中具有良好的抑制作用。MAGDALENO等［10］研究发现，糖尿病小鼠模型中氨基胍可通过抑制ERK/Smad通路传导抑制胶原纤维合成，保护心脏免受纤维化损伤。YAO等［11］研究表明，氨基胍预处理可明显减轻自发性高血压大鼠心肌纤维化。AHMAD等［12］研究证实，氨基胍可抑制阿米卡星诱导的氧化应激作用。LV等［13］研究证实，氨基胍可降低肾小球细胞中MMP-9表达，抑制肾间质纤维化历程，保护糖尿病肾病大鼠肾脏。本研究通过气管滴注博莱霉素构建大鼠PF模型，结果表明，与模型组相比，实验组大鼠肺组织W/D明显降低，解剖学和PF组织病理明显改善，胶原沉积区域明显减小，肺组织中MMPs/TIMPs表达趋于平衡，表明氨基胍对PF治疗效果良好。

TGF-β1/Smads是国际公认的致器官纤维化关键信号通路。TGF-β1被认为是最重要的肺脏致纤维化作用因子之一［14］。研究表明，TGF-β1高表达是PF形成的中心环节，尤其是在肺成纤维细胞中［15］。张丹等［16］研究证实，TGF-β1可明显促进新生大鼠成纤维细胞体外增殖，促进其纤维化转换。Smads蛋白在肺间质纤维化细胞外基质形成中发挥重要作用。Smad2是TGF-β1的受体蛋白，可将信号转移至核内启动胶原基因表达；Smad7是丝氨酸/苏氨酸激酶（serine/threonine kinase，STK）的拮抗蛋白，阻止激活型Smad2磷酸化。LI等［17］研究证实，抑制Smad2磷酸化可明显减轻由二氧化硅诱导的肺纤维化。LUO等［18］研究证实，抑制TGF-β1表达，抑制Smad2磷酸化，增强Smad7磷酸化水平可明显抑制博来霉素诱导的大鼠PF历程。ZHANG等［19］研究报道，抑制TGF-β1/Smad2通路可有效保护博来霉素诱导的大鼠PF。NAMGUNG等［20］研究证实，氨基胍可明显抑制TGF-β1/Smad通路，抑制纤维化，保护糖尿病肾病大鼠肾脏组织。本研究发现，与模型组相比，实验组大鼠肺组织中TGF-β1和p-Smad2 mRNA和蛋白表达明显降低，p-Smad7 mRNA和蛋白表达明显升高。因此推测氨基胍对博来霉素诱导的大鼠PF的保护作用可能与调控TGF-β1/Smads信号通路表达有关。

综上所述，氨基胍可保护博来霉素诱导的PF大鼠肺组织，可能通过调控TGF-β1/Smads信号通路，抑制TGF-β1和p-Smad2表达，增强p-Smad7表达发挥抗纤维化作用。但氨基胍是否通过其他通路影响PF进程有待进一步研究。