FGFR3、MI及Ki67联合检测在T1期膀胱尿路上皮癌病理分级中的价值研究

杨建平 李春君 罗文奇 陈肖瑜 黄冬梅 马韵 曾丽霞

【摘要】 目的 T1期膀胱尿路上皮癌（urothelial bladder cancer，T1 UBC）的病理腫瘤分级对于患者的预后及治疗决策有重要意义，但病理两级分级系统的诊断可重复性有限，该研究旨在寻找客观且易于检测的标志物用于T1 UBC的病理分级。

方法 收集经尿道膀胱肿瘤电切术、病理诊断为膀胱尿路上皮病变共139例，其中非癌性病变24例，T1期的UBC 115例。联合检测一系列以往研究提示在UBC的诊断及预后判断中常见的且有一定价值但尚存争议的因子，如肿瘤细胞的核分裂象/核分裂指数（mitotic figure/index，MF/MI）、细胞增殖指数Ki67以及成纤维细胞生长因子受体3（fibroblast growth factor receptor 3，FGFR3），评估它们在T1 UBC的病理分级诊断中的应用价值。

结果 MI、Ki67及FGFR3与T1 UBC的病理诊断和级别有关（P<0.05）。联合检测MI、Ki67及FGFR3多因素诊断模型可以提高T1 UBC病理级别诊断的准确性（AUC=0.906，95% CI：0.838～0.953，P<0.05）。

结论 MI、Ki67及FGFR3蛋白表达是UBC诊断中有意义的指标。联合检测MI、Ki67及FGFR3的多因素诊断模型可以提高T1 UBC的病变级别诊断准确性。

【关键词】 膀胱尿路上皮癌;成纤维细胞生长因子受体3;Ki67;核分裂象

中图分类号：R737.1 文献标志码： DOI：10.3969/j.issn.10031383.2021.06.004

Study on value of combined detection of FGFR3， MI and Ki67 in pathological grading of stage T1 bladder urothelial carcinoma

YANG Jianping， LI Chunjun， LUO Wenqi， CHEN Xiaoyu， HUANG Dongmei， MA Yun， ZENG Lixia▲

（Department of Pathology， Tumor Hospital Affiliated to Guangxi Medical University， Nanning 530021， Guangxi， China）

【Abstract】 Objective The pathological grading of stage T1 urothelial bladder cancer （T1 UBC） is of great significance for the prognosis and treatment decisionmaking of patients. However， the diagnostic repeatability of the twostage pathologicaclassification system is limited. This study aims to find objective and easy to detect markers for the pathological grading of T1 UBC.

Methods A total of 139 patients with urothelial bladder lesions who diagnosed pathologically after transurethral resection of the bladder tumor （TURBT） were collected， including 24 cases of noncancerous lesions and 115 cases of T1 UBC. A series of previous studies have suggested some common and valuable but controversial factors in the diagnosis and prognosis of UBC， such as mitotic figure/index （MF/MI） of tumor cell， cell proliferation index Ki67， and fibroblast growth factor receptor 3 （FGFR3）， and the value of these factors in the pathological grading diagnosis of T1 UBC was evaluated.

Results MI， Ki67 and FGFR3 were correlated with pathological diagnosis and grade of T1 UBC （P < 0.05）. The combined detection of the MI， Ki67 and FGFR3 in a multivariate diagnostic model could improve the diagnostic accuracy of T1UBC pathological grade （AUC=0.906， 95% CI： 0.838-0.953， P < 0.05）.

Conclusion MI， Ki67 and FGFR3 protein expressions are significant indicators in the diagnosis of UBC. The combined detection of the MI， Ki67 and FGFR3 in a multivariate diagnostic model can improve the diagnostic accuracy of T1 UBC pathological grade.

【Key words】 UBC; FGFR3; Ki67; MF

膀胱尿路上皮癌（urothelial bladder cancer，UBC）是常见的恶性肿瘤，男性多于女性[1]。近年中国的发病率逐年上升[2]。约75%以上的患者初次诊断为非肌层浸润性膀胱癌（nonmuscle invasive bladder cancer，NMIBC），其中约20%为T1期的膀胱癌，即肿瘤侵犯固有层尚未侵及固有肌层[3]。病理分级是影响T1 UBC预后和指导治疗最重要的指标。目前UBC病理两级分级系统的诊断可重复性有限[4～6]。因此，急需寻找客观且易于检测的标志物用于T1 UBC的病理分级，避免过度或不当的治疗。成纤维细胞生长因子受体3（fibroblast growth factor receptor 3，FGFR3）基因异常是膀胱尿路上皮癌中常见的遗传学事件，但目前研究表明FGFR3蛋白表达与UBC的分级及分期仍存在争议。细胞增殖指数Ki67的过表达与UBC患者不良预后相关[7]。WHO肿瘤分类中提及核分裂象/核分裂指数（mitotic figure/index，MF/MI）与UBC的分级有关，但没有给出具体的阈值[8]。本研究联合检测FGFR3蛋白表达、细胞增殖指数Ki67和MI，旨在评估它们对T1 UBC病理分级的诊断应用价值。

1 材料与方法

1.1 患者及样本

收集广西医科大学附属肿瘤医院病理科2016年1月至2017年12月间经尿道膀胱肿瘤电切术后病理诊断为膀胱尿路上皮性病变且临床送检切缘均阴性共139例，根据世界卫生组织（WHO）2016年的膀胱癌分类，由两位有丰富泌尿系统疾病诊断经验的病理医生对本研究样本的组织切片进行回顾性分析。肿瘤的分期遵循the 8th edition of the International Union against Cancer/American Joint Committee on Cancer（UICC/AJCC），T1期膀胱癌指的是肿瘤浸润到上皮下结缔组织。离体标本用10%中性福尔马林固定，脱水、石蜡包埋、制成HE切片，光镜下观察。

1.2 核分裂象计数及核分裂指数

对139例膀胱尿路上皮性病变组织的HE切片进行光镜下观察，选取肿瘤组织中核分裂象（mitotic figure，MF）最活跃的区域进行计数，至少计数5个高倍视野（400×，0.2376 mm2），取平均值;核分裂指数（mitotic index，MI）是一种定量的核分裂象计数的方法，它将核分裂象的数目与肿瘤组织的面积（mm2）相结合，是指平均1个高倍视野下的核分裂象数目。

1.3 分子标记的免疫组化检测

FGFR3（鼠抗人单克隆抗体：SC13121）及Ki67（鼠抗人单克隆抗体：MIB1）即用型一抗、SuperVision两步法即用型免疫组化二抗和DAB显色液均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。采用免疫组化SuperVision两步法检测FGFR3及Ki67增殖指数的蛋白表达。存档蜡块5 μm厚连续切片，常规脱蜡和水化后，按试剂盒操作说明书依次完成抗原修复、一抗及二抗孵育，DAB显色2分钟，苏木素复染及封片观察。

结果判读：Ki67阳性定位为细胞核着色;选取肿瘤组织中阳性细胞热点的区域，至少计数5个高倍视野，得平均Ki67增殖指数（阳性细胞百分率）。FGFR3阳性定位为细胞膜及细胞质着色;结合每个样本的阳性细胞百分率和染色强度综合评分，（1）阳性细胞百分率：0～5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分。（2）阳性细胞染色强度：未着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。两项乘积作为表达强度的总分：0分为阴性（0），1～4分为弱阳性（1+），5～8分为中等阳性（2+），9～12分为强阳性（3+）。

1.4 统计学方法

计量资料采用t检验或方差分析。分类资料采用卡方检验。等级资料组间比较采用秩和检验。运用二元logistic回归分析，构建MI、Ki67增殖指数及FGFR3三者联合的T1 UBC病理级别诊断模型。所有上述统计分析采用SPSS 22.0软件進行。使用MedCalc V15.8软件绘制受试者工作特性曲线（ROC曲线），计算单个肿瘤标志物和联合诊断模型的ROC曲线下面积（AUC）、约登指数、灵敏度以及特异度，并对AUCs进行Z检验比较。检验水准：α= 0.05，双侧检验。

2 果

2.1 患者的特征

139例研究对象中，非癌性病变24例，包括17例良性病变（6例增生性/腺性膀胱炎、4例黏膜慢性炎、1例乳头状瘤、6例内翻性乳头状瘤）及7例低度恶性潜能的乳头状尿路上皮肿瘤（papillary urothelial neoplasms of low malignant potential，PUNLMP）。T1 UBC 115例（42例低级别、73例高级别）。T1 UBC患者中男性102例，女性13例，男女比例为7.85∶1，中位年龄61岁。乳头状生长方式72例，非乳头状生长方式43例。病变个数>3的有74例，≤3的有41例。病变直径≥3 cm的有66例，<3 cm的有49例。

2.2 FGFR3及细胞增殖标记与膀胱尿路上皮病变性质的关系

139例膀胱尿路上皮病变中，FGFR3、Ki67、MI与病变的性质有关（P<0.05）。在膀胱良性病变、PUNLMP、低级别UBC和高级别UBC各组中FGFR3蛋白的阳性率依次为23.53%，71.43%，80.95%及56.16%，差异有统计学意义（P<0.001）;在非良性病变中，FGFR3在PUNLMP以及低级别UBC中表达率较高。Ki67增殖指数及MI与病变程度呈正相关（r=0.749，r=0.685）;从良性病变、PUNLMP到低级别癌，Ki67及MI逐步增高。见表1。

2.3 FGFR3及细胞增殖标记与T1 UBC病理级别的关系

115例T1 UBC中，FGFR3在低级别T1 UBC的阳性表达率（80.95%）高于高级别（56.16%），差异有统计学意义（P<0.001）。高级别T1 UBC的Ki67及MI的分布高于低级别，差异有统计学意义（P<0.001）。而年龄、性别、病变个数及大小、乳头状生长方式与T1 UBC病理分级无关（P>0.05）。見表2。

2.4 联合诊断模型在T1 UBC病理级别中的诊断效能

单因素分析结果显示MI、Ki67、FGFR3与T1 UBC病理级别相关，将影响T1 UBC病理分级诊断的这三个参数赋值（表3）并纳入多因素logistic回归分析（表4），建立MI、Ki67及FGFR3三个指标的联合诊断模型。图1绘制了MI、Ki67及FGFG3单独以及三者联合在TI UBC病理学级别诊断的ROC曲线。联合诊断模型AUC值（0.906）比Ki67、MI、FGFR3单独检测的AUC值（分别为0.862，0.818，0.695）高。通过Z检验，比较了联合诊断模型和单独检测各标记的AUCs。在TI UBC中，与MI、Ki67及FGFR3三者联合检测相比，MI、Ki67和FGFR3的Z值分别为9.682、8.123和3.937（P均<0.001），表明在TI UBC中联合检测与单个标记检测AUCs有统计学意义（P<0.05）。此外，我们发现在诊断T1 UBC病理级别ROC中，MI的最佳阈值为2/HPF（视野面积：0.2376 mm2），即当MI>2时被诊断为高级别，MI≤2时被诊断为低级别;Ki67最佳阈值为20%，即当Ki67>20%时被诊断为高级别，Ki67≤20%时被诊断为低级别。综上所述，联合MI、Ki67增殖指数及FGFR3诊断模型可以更好地诊断T1 UBC病理学级别（表5，图1）。

3 论膀胱癌患者的治疗是基于疾病的分期和分级，复发和进展的风险往往通过UBC的肿瘤分级来衡量，因此准确的分级对T1 UBC患者获得更好的治疗决策和预后至关重要。在病理诊断中需要把组织结构和细胞的异型性，包括细胞的密度、极向，细胞核的大小、形态、染色质、核仁及核分裂象等各种形态学要素综合考虑以得出正确的UBC分级诊断，但在实际工作中诊断可重复性不高。目前缺乏理想而客观的标志物用于UBC的病理分级。本研究联合检测一系列以往研究提示在UBC的诊断及预后判断中常见的且有一定价值，但尚存争议的因子，旨在评估它们在T1 UBC的病理分级中的应用价值。

FGFR3属于酪氨酸激酶受体家族（FGFR14）成员之一，在多发性骨髓瘤、宫颈癌、肺癌、脑膜瘤以及乳腺癌等多种肿瘤中发现了FGFR3基因异常，尤其以膀胱癌多见。FGFR突变存在于70%以上的低级别、非浸润性膀胱癌中，与较高的复发率相关，且是具有良好预后的膀胱癌亚组的特征[9]。大多数研究报道FGFR3蛋白表达与肿瘤分期、分级有显著的相关性[10～13]。然而国内学者对84例膀胱癌患者进行FGFR3与临床病理参数比较中并未发现差异[14]。本研究我们发现在T1 UBC中低级别和高级别FGFR3蛋白的阳性率分别为80.95%及56.16%，FGFR3蛋白表达与较低的UBC级别密切相关，与AKANKSHA等人[15]报道的FGFR3在NMIBC低级别（82.60%）及高级别（66.70%）表达结果类似。此外，除了低级别T1 UBC，我们还发现FGFR3在低度恶性潜能的乳头状尿路上皮肿瘤高表达（71.43%），与BARBISAN等人[16]的研究报道一致。基因突变、融合以及FGFR3的过表达可能是其致瘤作用的主要机制。研究表明FGFR3过度表达可导致MAPK和AKT信号通路的上调，导致癌细胞生长和转移[17]。关于FGFR3过表达引起膀胱癌变的机制仍需要进一步的研究证实。我们的实验结果显示FGFR3主要在PUNLMP以及低级别T1 UBC中表达，提示FGFR3可能是低级别非浸润性尿路上皮癌变过程中的重要事件。

在肿瘤中，MF的数量与类型是区别良、恶性和提示恶性程度及预后十分有效的指标[18]。一项310例膀胱肿瘤的多中心研究利用增殖和定量标记对Ta～T1期尿路上皮癌进行客观分级，发现核大小和核分裂象这两个可量化指标与NMIBC的级别和进展相关[19]。2016 WHO分类中提及MF与UBC的分级有关，但没有推荐的阈值。研究表明用面积校正的核分裂指数（mitotic figure/volume，M/V）是UBC的独立预后信息，M/V阈值为10/mm2[20]。本研究中采用的MI是一种类似于用M/V指数定量分析核分裂象数目的方法，它将核分裂象的数目与肿瘤组织的面积（mm2）相结合。在本研究中，我们发现MI与病变恶性程度以及T1 UBC的病理分级有关，MI的最佳阈值为2/HPF（视野面积：0.2376 mm2）接近10/mm2。作为组织形态学参数，MI的计数可操作性强，诊断重复性好，利于UBC个体化诊疗的精准评判。

Ki67是一种核蛋白，在除G0以外细胞周期的所有阶段中高表达，使得Ki67被广泛用作人类肿瘤细胞的增殖标志物[21]。研究表明，高的Ki67增殖指数作为细胞周期活性重要标记与UBC的复发和进展密切相关[22]。陈倩倩等[23]研究了Ki67在T1期非肌层浸润性膀胱癌中的表达，与肿瘤分级具有相关性，但与复发无相关性。在本研究中，我们发现Ki67增殖指数与膀胱尿路上皮病变恶性程度以及T1 UBC的病理分级有关。目前Ki67过表达的阈值在UBC研究中差异很大，过表达阈值从5%到25%不等[24]，可能与样本及检测方法的选择不同有关。本研究在诊断T1 UBC病理级别时，Ki67最佳阈值为20%，是诊断膀胱癌病理级别的有效指标。

目前关于联合各分子/标记的UBC病理分级诊断模型研究较少。VAN RHIJN等人[25]对286例原发性UCC患者应用测序方法检测FGFR3的基因突变，并用免疫组化检测MIB1、P53和P27的表达水平，分别用分子分型、临床病理形态学分级评估UCC的复发率和病变进展程度，并比较同一系列患者病理分级和分子分型的一致性，发现FGFR3突变以及Ki67、P53和P27分子分型系统与病理分级相比可以更准确地评估UCC患者的预后，比传统的临床病理学评估具有更高的重复性。BOSSCHIETER等人[19]利用细胞增殖标志物分析BC分级诊断价值，发现联合MNA10和MAI对于高级别肿瘤的AUC为0.92，敏感性为92%，特异性为76%。本研究联合检测FGFR3、MI及Ki67，构建T1 UBC病理分级的诊断模型，AUC为0.906，敏感性为78.08%，特异性为95.24%。结果表明，联合多变量（MI、Ki67及FGFR3）诊断模型可以提高T1 UBC级别诊断的准确性。

本研究結果提示MI、Ki67增殖指数及FGFR3蛋白表达是UBC诊断中有意义的指标。联合检测MI、Ki67及FGFR3的多因素诊断模型可以提高T1 UBC的病变级别诊断准确性。MI及Ki67增殖指数作为组织形态学和细胞增殖的重要标记，对其计数可操作性强，诊断重复性好，是现行的UBC病理分级和预后风险评估有意义的参数。

参 考 文 献

[1SIEGEL R L，MILLER K D，JEMAL A.Cancer statistics，2020[J].CA Cancer J Clin，2020，70（1）：730.

[2FENG R M，ZONG Y N，CAO S M，et al.Current cancer situation in China：good or bad news from the 2018 Global Cancer Statistics？[J].Cancer Commun，2019，39（1）：22.

[3KARL A.Cancer of the urinary bladder：Epidemiology，etiology，diagnosis of nonmuscle invasive bladder cancer[J].MMW Fortschr Med，2018，160（21/22）：4346.

[4Lamina propria microinvasion of bladder tumors，incidence on stage allocation （pTa vs pT1）：recommended approach.Pathologists of the French Association of Urology Cancer Committee[J].World J Urol，1993，11（3）：161164.

[5VAN DER MEIJDEN A，SYLVESTER R，COLLETTE L，et al.The role and impact of pathology review on stage and grade assessment of stages Ta and T1 bladder tumors：a combined analysis of 5 European Organization for Research and Treatment of Cancer Trials[J].J Urol，2000，164（5）：15331537.

[6VAN RHIJN B W，VAN LEENDERS G J，OOMS B C，et al.The pathologist's mean grade is constant and individualizes the prognostic value of bladder cancer grading[J].Eur Urol，2010，57（6）：10521057.

[7TIAN Y J，MA Z M，CHEN Z H，et al.Clinicopathological and prognostic value of ki67 expression in bladder cancer：a systematic review and metaanalysis[J].PLoS One，2016，11（7）：e0158891.

[8SOUKUP V，

APOUN O，COHEN D，et al.Prognostic performance and reproducibility of the 1973 and 2004/2016 World Health Organization grading classification systems in nonmuscleinvasive bladder cancer：a European association of urology nonmuscle invasive bladder cancer guidelines panel systematic review[J].Eur Urol，2017，72（5）：801813.

[9HERNNDEZ S，LPEZKNOWLES E，LLORETA J，et al.Prospective study of FGFR3 mutations as a prognostic factor in nonmuscle invasive urothelial bladder carcinomas[J].J Clin Oncol，2006，24（22）：36643671.

[10G MEZROMN J J，SAENZ P，MOLINA M，et al.Fibroblast growth factor receptor 3 is overexpressed in urinary tract carcinomas and modulates the neoplastic cell growth[J].Clin Cancer Res，2005，11（2 Pt 1）：459465.

[11MHAWECHFAUCEGLIA P，CHENEY R T，FISCHER G，et al.FGFR3 and p53 protein expressions in patients with pTa and pT1 urothelial bladder cancer[J].Eur J Surg Oncol，2006，32（2）：231237.

[12POYET C，HERMANNS T，ZHONG Q，et al.Positive fibroblast growth factor receptor 3 immunoreactivity is associated with lowgrade noninvasive urothelial bladder cancer[J].Oncol Lett，2015，10（5）：27532760.

[13VAN OERS J M，LURKIN I，VAN EXSEL A J，et al.A simple and fast method for the simultaneous detection of nine fibroblast growth factor receptor 3 mutations in bladder cancer and voided urine[J].Clin Cancer Res，2005，11（21）：77437748.

[14钟键，金正贤，卞卫星，等.膀胱癌组织FGFR3基因突变和蛋白表达与预后关系研究[J].中华肿瘤防治杂志，2020，27（2）：130135.

[15] AKANKSHA M，SANDHYA S.Role of FGFR3 in urothelial carcinoma[J].Iran J Pathol，2019，14（2）：148155.

[16BARBISAN F，SANTINELLI A，MAZZUCCHELLI R，et al.Strong immunohistochemical expression of fibroblast growth factor receptor 3，superficial staining pattern of cytokeratin 20，and low proliferative activity define those papillary urothelial neoplasms of low malignant potential that do not recur[J].Cancer，2008，112（3）：636644.

[17MAHE M，DUFOUR F，NEYRETKAHN H，et al.An FGFR3/MYC positive feedback loop provides new opportunities for targeted therapies in bladder cancers[J].EMBO Mol Med，2018，10（4）：e8163.

[18LIPPONEN P.Mitotic indexes as indicators of malignancy in human tumors[J].Int J Oncol，1992，1（3）：387392.

[19BOSSCHIETER J，HENTSCHEL A E，SAVCIHEIJINK C D，et al.Objectifying grade in TaT1 urothelial carcinomas of the bladder using proliferative and quantitative markers：a multicentre study in 310 bladder tumors[J].Urol Oncol，2019，37（8）：530.e1530530.e8.

[20LIPPONEN P K，ESKELINEN M J，JAUHIAINEN K，et al.Independent clinical，histological and quantitative prognostic factors in transitionalcell bladder tumours，with special reference to mitotic frequency[J].Int J Cancer，1992，51（3）：396403.

[21GERDES J，SCHWAB U，LEMKE H，et al.Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated with cell proliferation[J].Int J Cancer，1983，31（1）：1320.

[22BERTZ S，OTTO W，DENZINGER S，et al.Combination of CK20 and Ki67 immunostaining analysis predicts recurrence，progression，and cancerspecific survival in pT1 urothelial bladder cancer[J].Eur Urol，2014，65（1）：218226.

[23陈倩倩，杜君，林瑞，等.Ki67在T1期非肌层浸润性膀胱癌中的表达及意义[J].中国肿瘤临床，2017，44（7）：316320.

[24KO K，JEONG C W，KWAK C，et al.Significance of Ki67 in nonmuscle invasive bladder cancer patients：a systematic review and metaanalysis[J].Oncotarget，2017，8（59）：100614100630.

[25VAN RHIJN B W，VIS A N，VAN DER KWAST T H，et al.Molecular grading of urothelial cell carcinoma with fibroblast growth factor receptor 3 and MIB1 is superior to pathologic grade for the prediction of clinical outcome[J].J Clin Oncol，2003，21（10）：19121921.

（收稿日期：2021-01-20 修回日期：2021-04-25）

（編辑：潘明志）